陳麗歡 徐德平 孔佳美 姚明華 張 東 古麗拜克熱木 高靜秋

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

遠(yuǎn)志又名細(xì)葉遠(yuǎn)志，是可用于保健食品的中藥[1]，具有安神、祛痰、消腫等多種功效[2]。據(jù)報道[3]，遠(yuǎn)志主要成分為皂苷，此外還包括糖、哐山酮類、香豆素等多類化合物。有研究[4-8]表明，生遠(yuǎn)志高劑量能協(xié)同戊巴比妥鈉呈現(xiàn)明顯的催眠作用，同時也證明[9]中樞系統(tǒng)中，單胺類遞質(zhì)如多巴胺、5-羥色胺等在睡眠調(diào)節(jié)中起著重要的作用。但未有關(guān)于遠(yuǎn)志起助眠作用的具體物質(zhì)以及作用機(jī)制的研究。

本試驗(yàn)從遠(yuǎn)志藥材的提取分離擬對遠(yuǎn)志醇提物的不同萃取物助眠作用進(jìn)行研究，并通過直接睡眠法和分析小鼠海馬區(qū)多巴胺含量的變化得到遠(yuǎn)志助眠的功效物質(zhì)；通過HPLC-MS和NMR對該物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，為遠(yuǎn)志進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

遠(yuǎn)志：產(chǎn)地山西；

ICR 小鼠：18～22 g，南京模式動物研究所；

DA標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；

硅膠板：GF254，山東煙臺芝罘化工廠；

Octadecylsilyl(ODS)填料：北京綠百草科技發(fā)展有限公司；

Middle Chromatogram Isolated Gel( MCI )填料：三菱化學(xué)控股集團(tuán)；

丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

甲醇、磷酸氫二鈉：色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

萃取罐：RAT-100 型，上海錦賦實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：XHRE-1002型，廣州予華儀器有限公司；

攝像頭：LS-Q130W-1型，廣東東莞市盛鼎電子科技有限公司；

恒流泵：SYB106-100 型，天津市科器高新技術(shù)公司；

暗箱式紫外透射儀：ZF-90 型，上海顧村電光儀器廠；

可見分光光度計：V-5100B 型，上海元析儀器有限公司；

自動部分收集器：BS-160ABS-160A 型，上海金鵬分析儀器有限公司；

超聲波清洗器：FRQ-1002T 型，杭州法蘭特超聲波有限公司；

高效液相色譜儀(紫外+熒光檢測器)(反相)：1525型，美國沃特世公司；

液質(zhì)聯(lián)用儀：MALDI SYNAPT MS 型，美國沃特世公司；

核磁共振儀：Avance 500 MHz型，美國Bruker 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將20 kg遠(yuǎn)志粉碎，過30目篩后，放入體積為100 L的提取罐中，按料液比1∶10 (g/mL)加入75%的乙醇，60 ℃攪拌提取3 h，取上清液后，渣重復(fù)提取2次。將3次所得上清液濃縮后得遠(yuǎn)志乙醇提取物。將乙醇提取物和去離子水1∶1 (g/mL)混合后，依次用相同體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取、濃縮后得石油醚萃取物(Ⅰ)、乙酸乙酯萃取物(Ⅱ)、正丁醇萃取物(Ⅲ)以及萃余物(Ⅳ)，于-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 遠(yuǎn)志醇提物不同溶劑萃取物的助眠作用 取50只ICR小鼠，10只/組，共5組，分別進(jìn)行灌胃。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4組試驗(yàn)小鼠的灌胃劑量均為1 g/kg·BW，對照組給等量生理鹽水，1次/d。1周后，觀察灌胃30 min內(nèi)小鼠的睡眠率、灌胃結(jié)束后12 h內(nèi)小鼠的睡眠時間。

1.2.3 乙酸乙酯萃取物的分離 將遠(yuǎn)志醇提物的乙酸乙酯萃取物上MCI(5 cm×100 cm)柱，依次用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液(30%，50%，70%，95%)洗脫，通過薄層色譜法(TLC)檢測洗脫液中的成分，根據(jù)TLC檢測結(jié)果合并相同成分的洗脫液，分成A(30%洗脫)、B(50%洗脫)、C(70%洗脫)、D(95%洗脫)4個部分。將其分別減壓濃縮，于-18 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 乙酸乙酯萃取物不同分離組分的助眠效果 取50只ICR小鼠，10只/組，共5組，分別給藥灌胃。A、B、C、D 4組小鼠的劑量為500 mg/kg·BW，對照組(CK)小鼠給等量生理鹽水，1次/d。1周后，觀察灌胃30 min內(nèi)小鼠的睡眠率、灌胃結(jié)束后12 h內(nèi)小鼠的睡眠時間。

1.2.5 測定腦組織多巴胺含量

(1) 制備勻漿：使用異弗烷麻醉小鼠后進(jìn)行經(jīng)心灌注。將小鼠斷頭處死，迅速剝?nèi)∪X，置冰盤中，分離出小鼠左、右海馬區(qū)，-80 ℃冰凍保存?zhèn)溆肹9]。

稱取海馬區(qū)0.2 g，加入0.1 mol/L的高氯酸300 μL后置于冰盤上碾碎1 min。以15 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜后，進(jìn)樣分析[10]。

(2) 色譜條件：根據(jù)文獻(xiàn)[11]修改如下，pH 3.0；流速1.0 mL/min；檢測波長280～320 nm；柱溫10 ℃；進(jìn)樣量15 μL。

1.2.6 遠(yuǎn)志助眠活性部位的成分分離 將1.2.4中助眠效果好的組分減壓濃縮后上樣到MCI 柱(5 cm× 100 cm)，依次用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫，薄層色譜層析法檢測洗脫液中的成分，并根據(jù)結(jié)果將相同成分合并，濃縮后重復(fù)過MCI(5 cm×100 cm)柱，得到主要成分的較純化合物A。

1.2.7 遠(yuǎn)志助眠活性部位的成分檢測

(1) 發(fā)泡性試驗(yàn)：皂苷能降低水溶液表面張力，產(chǎn)生的泡沫不因加熱而消失[12]。取0.5 g化合物A，加水5 mL溶解，煮沸10 min后濾出水溶液。

(2) 氯仿-硫酸反應(yīng)：取0.5 g樣品溶于氯仿，加入濃硫酸后分層，氯仿層呈紅色，硫酸層顯綠色熒光。通過上述現(xiàn)象則可判斷為皂苷。

(3) Lieberman-Burchard反應(yīng)：將試樣溶于氯仿，加入濃硫酸-乙酐(1∶20)數(shù)滴，呈黃→紅→藍(lán)→紫→綠色的變化后，觀察最后的成色。

(4) 結(jié)構(gòu)檢測：使用液質(zhì)聯(lián)用儀(HPLC-MS)推斷樣品的結(jié)構(gòu)成分。

HPLC-MS檢測條件：檢測波長200～400 nm；分析柱為BEHC18柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)；流動相：0.1%甲酸洗脫40 min → 乙腈和0.1%甲酸混合液(體積比3∶7)洗脫45 min → 乙腈和0.1%甲酸混合液(體積比8∶2)洗脫50 min → 100%乙腈洗脫55 min → 0.1%甲酸洗脫35 min；柱溫45 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

(5) 核磁共振分析：以二甲基亞砜-d6(DMS-d6)為溶劑，四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)物，將得到的化合物經(jīng)氫譜和碳譜等光譜數(shù)據(jù)分析，確定其結(jié)構(gòu)。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行分析。組間差異比較采用單因素方差分析，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 遠(yuǎn)志醇提物的不同溶劑萃取物的助眠作用

由表1可知，在不同溶液的萃取物中，遠(yuǎn)志乙酸乙酯萃取物的試驗(yàn)小鼠睡眠率、睡眠時間均為最佳，助眠效果最顯著，且與空白小鼠存在顯著性差異(P<0.01)；遠(yuǎn)志正丁醇萃取物試驗(yàn)小鼠的睡眠時間與空白小鼠也有顯著性差異(P<0.05)，但明顯低于乙酸乙酯萃取物的小鼠睡眠時間。

試驗(yàn)中遠(yuǎn)志醇提物不同溶劑萃取物明顯延長各組小鼠睡眠時間和睡眠率的現(xiàn)象，與北五味子多糖[13]能夠顯著延長小鼠睡眠時間的現(xiàn)象一致，由此推斷遠(yuǎn)志醇提物有助眠作用，且有效成分為遠(yuǎn)志醇提物乙酸乙酯萃取物。

2.2 乙酸乙酯萃取物不同組分對小鼠的助眠作用

由表2可知，遠(yuǎn)志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脫物的試驗(yàn)小鼠的睡眠率最高，為80%，同時平均睡眠時間最長，為509.6 min，且明顯高于其他各組的，同時具有顯著性差異(P<0.05)。

表1 不同萃取物對小鼠睡眠率和時間的影響?Table 1 Influence of extracts on sleep rate and time of mice

? a. 與對照組相比在P<0.05水平差異顯著；b. 與對照組相比在P<0.01水平差異顯著。

? a. 與對照組相比在P<0.05水平差異顯著；b. 與對照組相比在P<0.01水平差異顯著。

分析圖1，組別為遠(yuǎn)志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脫物的小鼠海馬區(qū)DA含量最高，與空白組相比效果最明顯(P<0.01)。組別為遠(yuǎn)志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱20%乙醇洗脫物、50%乙醇洗脫物、95%乙醇洗脫物的小鼠海馬區(qū)DA含量與空白組相比差異顯著(P<0.05)，明顯低于遠(yuǎn)志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脫物的試驗(yàn)組小鼠海馬區(qū)DA含量，同時具有顯著性差異(P<0.05)。

睡眠是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生的一個主動過程，與腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)，尤其是單胺類遞質(zhì)，如多巴胺、五羥色胺的動態(tài)變化有著極大的關(guān)聯(lián)，DA作為中樞神經(jīng)遞質(zhì)中最重要的組成部分，在睡眠-覺醒過程中起著極其重要的作用[9, 14-16]。因此，組別為遠(yuǎn)志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脫物的小鼠海馬區(qū)DA含量的顯著提高有利于該組小鼠睡眠率的提高、睡眠時間的延長，故推斷該部分為遠(yuǎn)志助眠的功效部位。

a. 與空白對照組比較在P<0.05水平差異顯著；b. 與空白對照組比較在P<0.01水平差異顯著

圖1 不同組別小鼠海馬區(qū)中多巴胺(DA)的積分峰面積

圖1 The peak areas of dopamine in different groups of mouse hippocampus region

綜合表2和圖1可知，遠(yuǎn)志醇提物乙酸乙酯萃取物中具有助眠作用的功效成分主要集中在MCI柱70%乙醇洗脫物中。

2.3 乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脫部分成分純化及分析

2.3.1 遠(yuǎn)志助眠活性成分的理化分析 70%乙醇洗脫部分具有很好的助眠作用，分離后得一個單體化合物A，其理化檢測結(jié)果見表3。

從表3可知，單體化合物A的各項理化檢測均呈現(xiàn)皂苷具有的性質(zhì)，故推斷該化合物為皂苷類物質(zhì)。

表3 各項檢測結(jié)果及其分析Table 3 Results and inferences of different physical tests and chemical analysis

2.3.2 HPLC-MS檢測 圖2為HPLC圖譜，圖3～5為主要化合物的質(zhì)譜圖。

圖2中主要有3個峰，即該部分主要有3種化合物組成，含量最多的化合物保留時間為6.99 min(圖5)，其與保留時間為6.93 min(圖4)的化合物為同分異構(gòu)體，對應(yīng)的分子量均為1 573，由于分子量為奇數(shù)，可以推斷化合物含有氮。

2.3.3 核磁共振分析 化合物A的13C-NMR和135dept圖譜見圖6。從圖6中可以看出化合物A不純，結(jié)合HPLC-MS檢測可以看出該組分含有2個同分異構(gòu)體，使用常規(guī)的色譜方法難以將其分離。但圖6(a)中可以看出在化學(xué)位移為20～60時，有明顯的皂苷信號，但為何種皂苷無法確定，同時也可看出在化學(xué)位移為60～105時有3個糖殘基，說明化合物含有1個由3個糖組成的糖鏈，其詳細(xì)結(jié)構(gòu)還在繼續(xù)研究中。

圖2 MCI柱70%乙醇洗脫物液相色譜圖Figure 2 The chromatography of elution fraction of 70% ethanol in MCI in HPLC

圖3 保留時間為6.76 min化合物的質(zhì)譜圖Figure 3 Mass spectrogram of the compound with the retention of 6.76 min

圖4 保留時間為6.93 min化合物的質(zhì)譜圖Figure 4 Mass spectrogram of the compound with the retention of 6.93 min

圖5 保留時間為6.99 min化合物的質(zhì)譜圖Figure 5 Mass spectrogram of the compound with the retention of 6.99 min

圖6 化合物A的13C-NMR和135dept圖譜Figure 6 13C-NMR spectrum and 135dept spectrum of A

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，遠(yuǎn)志助眠功效部位為遠(yuǎn)志醇提物乙酸乙酯萃取物MCI柱70%乙醇洗脫物；經(jīng)分離純化后所得的較純化合物A為2個互為同分異構(gòu)體的皂苷類物質(zhì)，該物質(zhì)分子量為1 573，且含有氮元素和1個由3個糖組成的糖鏈。本研究為遠(yuǎn)志功能成分的開發(fā)提供了依據(jù)。但化合物A的具體結(jié)構(gòu)仍需進(jìn)一步研究。