張召興，閆艷娟，李佩國(guó)，李蘊(yùn)玉，賈青輝，張香齋

(河北科技師范學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北秦皇島 066604)

雞致病性大腸埃希菌(E.coli)可以通過多種途徑感染不同日齡、品種的雞，引發(fā)雞的急性敗血癥、肝周炎等多種癥狀，具有很高的感染率和病死率，致病性E.coli血清型眾多復(fù)雜，不同的區(qū)域流行的血清型不同，其致病性也存在差異，雞致病性E.coli具有易產(chǎn)生耐藥性特點(diǎn)，不易控制，是影響?zhàn)B雞業(yè)發(fā)展的主要細(xì)菌性疾病[1-2]。根據(jù)單味中草藥對(duì)雞致病性E.coli地方流行株體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果，雞致病性大腸桿菌病的中獸醫(yī)理論辨證理論觀點(diǎn)及各種單味中草藥藥理作用，并與現(xiàn)在化中草藥超微粉技術(shù)結(jié)合，篩選出了能有效防治雞致病性E.coli復(fù)方中草藥超微粉。急性、亞慢性毒性試驗(yàn)是用來評(píng)價(jià)藥物使用安全性，被廣泛應(yīng)用新的藥物的研發(fā)和安全性評(píng)價(jià)[3]。急性毒性試驗(yàn)是驗(yàn)證藥物在短期內(nèi)對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物的毒性，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物1次或者24 h內(nèi)多次給藥；亞慢性毒性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物長(zhǎng)期使用毒性作用[4-5]。

本試驗(yàn)對(duì)篩選出來的抗雞致病性E.coli復(fù)方中草藥超微粉通過急性、亞慢性毒性試驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)價(jià)復(fù)方中草藥超微粉使用的安全性，為復(fù)方中草藥超微粉防治雞致病性E.coli臨床的安全使用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用藥物 黃連、甘草、當(dāng)歸、神曲等單味中草藥,秦皇島民樂醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試驗(yàn)用動(dòng)物 1日齡的健康海蘭灰雛雞共240只，購(gòu)于秦皇島市金牧種雞場(chǎng)，用無抗生素的全價(jià)日糧飼喂至14日齡。

1.1.3 主要儀器和試劑 DHP-9082型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技儀器有限公司生產(chǎn)；5804R型臺(tái)式高容量離心機(jī)，德國(guó)Eppendor公司產(chǎn)品；ND2000C型超微量分光光度計(jì)，德國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；Infinite M200PRO型酶標(biāo)儀，Tecan公司產(chǎn)品；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、尿素氮(BUN)、尿酸(UA) ，南京建成生物工程公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 藥物的制備 按照比例組合后制成超微粉，將制備的復(fù)方中草藥超微粉用滅菌水制成混懸液，使之濃度為500 mg/mL。

1.2.2 復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞的急性毒性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[6]，將14日齡質(zhì)量在85 g±2 g的90只雛雞平均分成9組，B組～G組給藥劑量分別為0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5 g/(kg·d)，A組給予等量的生理鹽水，連續(xù)觀察7 d，記錄中毒時(shí)間、癥狀及死亡數(shù)量，計(jì)算LD50。試驗(yàn)結(jié)束對(duì)雛雞處死，記錄病變情況。

1.2.3 復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞的最大耐受量試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[6-7]，選擇14日齡體重為85 g±2 g雛雞40只平均分成4組，B組～D組給藥劑量分別為5、15、25 g/(kg·d) ，A組為對(duì)照組給予等量的生理鹽水，觀察7 d，記錄中毒時(shí)間、癥狀及死亡數(shù)量，并對(duì)中毒的雛雞進(jìn)行剖檢，記錄病變情況。試驗(yàn)結(jié)束將雛雞處死，采集肝、腎等器官做組織病理學(xué)觀察。

1.2.4 復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞的亞慢性毒性試驗(yàn) 選擇14日齡體質(zhì)量相近的雛雞80只，平均分成4組。A組為對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，B組～D組在基礎(chǔ)日糧添加20、40、80 g/kg的復(fù)方中草藥超微粉至42日齡。在試驗(yàn)期間，記錄中毒時(shí)間、癥狀及死亡數(shù)量，并對(duì)中毒的雛雞進(jìn)行剖檢，記錄病變情況。給藥后的14 d和28 d進(jìn)行稱重，并隨機(jī)抽取5只雛雞采血后剖檢，以檢測(cè)肝、腎功能指標(biāo)和肝、腎等器官組織病理學(xué)變化。各組余下的雛雞停藥后繼續(xù)觀察14 d，進(jìn)行稱重。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

在試驗(yàn)過程中，試驗(yàn)雞的飲水與采食正常，未出現(xiàn)中毒及死亡情況，故計(jì)算不出復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞的LD50。試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)雞剖檢，其肝、腎等主要的器官也未出現(xiàn)病變。

2.2 復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞的最大耐受量試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)試驗(yàn)雛雞最大的給藥量為25 g/(kg·d)時(shí)，試驗(yàn)雞飲水與采食正常，未見其他異常表現(xiàn)和死亡情況。剖檢和病理組織學(xué)觀察，未見肝、腎等主要器官出現(xiàn)病變。

2.3 復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞的亞慢性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 臨床表現(xiàn)和病理觀察結(jié)果 亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，各組雛雞未發(fā)生死亡，飲水與采食正常，未見其他異常情況。各組雛雞的肝、腎等主要器官未出現(xiàn)病變，其病理組織學(xué)觀察也未見異常變化。

2.3.2 各組雛雞體質(zhì)量變化結(jié)果 由表1可見，隨中藥超微粉濃度的增加，體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，其中在試驗(yàn)后的第14天，20 g/kg組與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)，40 g/kg，80 g/kg添加組與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)。至試驗(yàn)的28 d和停藥后的14 d，20、40、80 g/kg添加組與對(duì)照組之間的差異不顯著(P>0.05)。

2.3.3 各組雛雞肝腎功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 由表2可知，在試驗(yàn)后的14 d和8 d，20、40、80 g/kg添加組雛雞血清中的GPT的含量與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)。

表1 復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞體質(zhì)量的影響

注：同列數(shù)據(jù)相同小寫字母或者無字母表示差異不顯著(P>0.05)，肩標(biāo)小寫字母不相同表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values with same letters or without letter mean no significant difference in the same column (P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

表2 不同濃度的復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞血清中GPT、GOT含量的影響

注：同列數(shù)據(jù)相同小寫字母或者無字母表示差異不顯著(P>0.05)，肩標(biāo)小寫字母不相同表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values with same letters or without letter mean no significant difference in the same column (P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

由表3可知，在試驗(yàn)后的14 d和28 d，隨復(fù)方中草藥超微粉濃度的增加，血清中的BUN含量呈下降趨勢(shì)，其中40 g/kg，80 g/kg添加組與20 g/kg添加組和對(duì)照組相比，差異顯著(P<0.05)。20、40、80 g/kg添加組雛雞血清中的UA的含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，但20、40、80 g/kg添加組之間差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同濃度的復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞血清中BUN、UA含量的影響

注：同列數(shù)據(jù)相同小寫字母或者無字母表示差異不顯著(P>0.05)，肩標(biāo)小寫字母不相同表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values with same letters or without letter mean no significant difference in the same column (P>0.05),and with different letters mean significant difference(P<0.05).

3 討論

3.1 復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞的急性毒性試驗(yàn)

急性毒性試驗(yàn)是對(duì)受試動(dòng)物在24 h內(nèi)1次或者多次給藥，驗(yàn)證其藥物在短期內(nèi)對(duì)受試動(dòng)物的毒性。本試驗(yàn)用防治雞致病性E.coli復(fù)方中草藥超微粉，對(duì)該藥物的最終的使用動(dòng)物(雛雞)進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn)，更準(zhǔn)確評(píng)價(jià)防治雞致病性E.coli復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞使用安全性。結(jié)果未檢測(cè)出復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞的LD50，因此，用復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞進(jìn)行了最大耐受量試驗(yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)試驗(yàn)雛雞最大的給藥量為25 g/(kg·d)時(shí)，試驗(yàn)雛雞未出現(xiàn)死亡情況，飲水與采食正常；剖檢后觀察各個(gè)試驗(yàn)組雛雞的肝、腎等主要器官未出現(xiàn)病變，病理組織學(xué)觀察也無異常變化，因此，雛雞對(duì)復(fù)方中草藥超微粉對(duì)最大耐受量超過25 g/(kg·d)[相當(dāng)于復(fù)方中草藥生藥量25 g/(kg·d)]。

3.2 復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞的亞慢性毒性試驗(yàn)

在雛雞的亞慢性毒性試驗(yàn)中，各個(gè)試驗(yàn)組的雛雞未出現(xiàn)死亡情況，飲水與采食正常，未見其他異常情況，剖檢與病理組織學(xué)檢查也未見異常。40 g/kg和80 g/kg的復(fù)方中草藥超微粉添加組的雛雞在用藥后14 d時(shí)的體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組，這可能是復(fù)方中草藥超微粉味道苦，添加高濃度的復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞的應(yīng)激比較大，影響了采食量，從而使雛雞生長(zhǎng)緩慢，隨著對(duì)含不同濃度的復(fù)方中草藥超微粉飼料的適應(yīng)，在試驗(yàn)后的28 d及停藥后的14 d，雛雞的體質(zhì)量增加量逐漸提高，并與對(duì)照組比較無顯著差異，與李應(yīng)超等[6]研究酸棗仁對(duì)羅曼雛雞的亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果一致。

血清中的GOT和GPT含量的變化是評(píng)價(jià)肝臟功能重要指標(biāo)[8-9]。當(dāng)動(dòng)物機(jī)體肝臟受到損傷時(shí)，導(dǎo)致機(jī)體物質(zhì)代謝異常、紊亂，血清中的GOT和GPT含量增加。雛雞亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，添加20、40、80 g/kg復(fù)方中草藥超微粉后14 d和28 d的血清中的GPT和GOT含量與對(duì)照組比較均差異不顯著，從而證實(shí)復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞的肝臟無損傷作用，與官麗輝等[9]、索朗扎西等[10]報(bào)道的一致。腎臟是動(dòng)物機(jī)體物質(zhì)代謝產(chǎn)物的主要的排泄器官，其中，尿酸(UA)、血尿素氮(BUN)是動(dòng)物體物質(zhì)代謝主要的產(chǎn)物，也是反映腎功能主要的指標(biāo)[11-12]。在雛雞的亞慢性毒性試驗(yàn)中，試驗(yàn)組的雛雞血清中的BUN、UA含量低于對(duì)照組，證實(shí)了復(fù)方中草藥超微能提高雛雞的腎臟的代謝水平，減少對(duì)腎臟的損傷。與張召興等[12]，張立永等[13]報(bào)道的一致。

急性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞是無急性毒副作用，最大耐受量超過25 g/(kg·d)，亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方中草藥超微粉對(duì)雛雞臨床上連續(xù)服用是安全的。