萬壽菊油揮發(fā)性成分的GC-MS保留指數(shù)定性分析

董世良，陳一，劉冰，馬舒翼，肜霖，尹團章，曹林海，吳昭，趙國豪，*

（1.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖北武漢430040；2.鄭州輕工業(yè)學(xué)院，河南鄭州450000）

萬壽菊（Tagetes Erecta L.），又名臭芙蓉，為菊科、萬壽菊屬，一年生草本植物，管狀花花冠黃色，原產(chǎn)于墨西哥。中國各地均有分布。萬壽菊油作為食品香料，主要應(yīng)用于糖果、飲料、調(diào)味品等食品中[1]，可經(jīng)水蒸氣蒸餾法[1]、同時蒸餾－萃取法[2]，微波輔助萃取法[3]等方式由其莖葉或花中獲取。目前國內(nèi)報道的萬壽菊油揮發(fā)性成分分析方法[1－3]大多采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography－mass spectrometry，GC－MS）檢測，再根據(jù)譜庫檢索定性化合物，難以準(zhǔn)確區(qū)分萬壽菊油中存在的同分異構(gòu)體化合物，無法為制定萬壽菊油產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

保留指數(shù)定性則可在無標(biāo)樣時利用文獻中的保留指數(shù)定性，方法誤差可小于1%。該方法已廣泛應(yīng)用于中藥、精油等樣本的揮發(fā)性成分的定性分析[4－7]。本文引入保留指數(shù)輔助定性方法，采用保留指數(shù)結(jié)合質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索（National Institute of Standards and Technology，NIST）的方式對萬壽菊油揮發(fā)性成分進行分析和定性，進一步為萬壽菊油作用效果研究和質(zhì)量控制提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萬壽菊油：深圳波頓香料有限公司；無水乙醇、無水硫酸鈉：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；正構(gòu)烷烴混合對照品 C8－C40：美國 Sigma－Aidrich 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6890A/5973N氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取萬壽菊油0.1 g，用無水乙醇將其稀釋100倍，再加入無水硫酸鈉進行干燥，進樣前采用0.45 μm有機相濾膜過濾。

1.3.2 GC－MS的分析條件

色譜條件：毛細(xì)管柱DB－5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為 He；恒流模式，體積流量 1 mL/min；進樣量1 μL；分流進樣，分流比10∶1；進樣口溫度為220℃；升溫程序為初始溫度40℃，保持1 min，以3℃/min的速率升溫至280℃，保持5 min；溶劑延遲時間為4 min。

質(zhì)譜條件：傳輸線溫度為240℃；離子源為EI源；電子能量為70 eV；離子源溫度：250℃；全掃描范圍（m/z）：40～550。

1.4 保留指數(shù)（KI）的計算

按照上述1.3.2的條件對正構(gòu)烷烴混合對照品C8－C40進行GC－MS分析，記錄各正構(gòu)烷烴保留時間，根據(jù)線性升溫公式計算各組分的KI，KI=100n+

式中：tx為被分析組分流出峰的保留時間，min；tn和tn+1為碳原子數(shù)為n和n+1的正烷烴流出峰的保留時間，min，且 tn

2 結(jié)果與分析

2.1 萬壽菊油揮發(fā)性成分分析

采用GC－MS分析萬壽菊油揮發(fā)性成分，其GC/MS譜圖見圖1。

由圖1可知，萬壽菊油揮發(fā)性香氣成分氣質(zhì)譜圖中色譜峰眾多，化學(xué)組分復(fù)雜，采用峰面積歸一化法計算圖1中萬壽菊油揮發(fā)性香氣中各組分的峰面積相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，然后選取相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.1%的化學(xué)成分進行分析。選取各色譜峰質(zhì)譜匹配度高的可能物質(zhì)，通過文獻檢索其KI*值并與計算所得的該色譜峰KI值相比較，以檢索所得KI*值和計算所得KI值相似度最高的化合物為最適合的檢索結(jié)果，具體結(jié)果見表1。

由圖1和表1可知，本試驗通過GC－MS分析從萬壽菊油中共檢出50個組分，采用保留指數(shù)和質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索相結(jié)合的雙重定性的方法從萬壽菊油中共鑒定出39種主要成分，占其揮發(fā)性成分總量的97．99%，其主要組分中含量較高的組分為：當(dāng)歸酸－3－甲基戊酯（12.58%）、異丁酸異戊酯（11.08%）、（1S）－（－）－α 蒎烯（10.91%）、丁酸異丁酯（10.38%）、（Z）－2－甲基－2丁烯酸2－甲基－丙酯（9.95%）以及異丁酸－4甲基戊酯（7.79%）。

圖1 萬壽菊油揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.1 Total ions chromatogram of volatile compound in extracted oil of Tagetes Erecta L.flowers

表1 萬壽菊油揮發(fā)性成分的鑒定結(jié)果Table 1 Results of compounds in extracted oil of Tagetes Erecta L.flowers

續(xù)表1 萬壽菊油揮發(fā)性成分的鑒定結(jié)果Continue table 1 Results of compounds in extracted oil of Tagetes Erecta L.flowers

2.2 保留指數(shù)在萬壽菊油揮發(fā)性組分定性研究中的應(yīng)用

本文經(jīng)質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索（NIST）后，利用保留指數(shù)進行輔助定性，縮小了檢索范圍，能夠提高天然化合物定性的準(zhǔn)確性，盡量減少誤判和錯判。對檢索出的39個化合物進行定性分析時，發(fā)現(xiàn)許多酮類、酯類、醇類等化合物，若僅用質(zhì)譜庫檢索定性會難以判定甚至誤判，尤其是同系物和同分異構(gòu)體的確定。保留指數(shù)在萬壽菊油揮發(fā)性成分鑒定中的應(yīng)用實例見表2。

如表2所示，本試驗中保留時間為15.97 min的位置存在一個色譜峰，通過GC-MS的NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索分析，獲得4個相似度較高的化合物，按匹配度高低排序排為異丁酸-2-甲基丁酯（925）、丁酸異戊酯（903）、異丁酸異戊酯（897）和丁酸戊酯（886），經(jīng)比對保留指數(shù)文獻可知，上述4種酯的保留指數(shù)分別為1 016、1008、1013、1062，故根據(jù)實測保留指數(shù)（1056），可判斷化合物應(yīng)為丁酸戊酯。保留時間為22.62 min位置的色譜峰，通過GC-MS的NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索分析，獲得兩個相似度較高的化合物，按匹配度高低排序是順式-茴香腦（917）和對烯丙基茴香醚（891），經(jīng)比對保留指數(shù)文獻值，可知順式-茴香腦和對烯丙基茴香醚的文獻值分別為1 209和1 196，與實測保留指數(shù)（1 195）相較，應(yīng)判定該化合物為對烯丙基茴香醚。此外，異丁酸異戊酯、桉葉油醇、丙酸己酯、（-）-反式一松香芹醇、冰片、松香芹酮、（E）-2-甲基-2丁烯酸2-甲基烯丙酯等化合物的定性同樣須經(jīng)保留指數(shù)輔助方可確認(rèn)。通過質(zhì)譜庫檢索結(jié)合保留指數(shù)法，可準(zhǔn)確判定萬壽菊油揮發(fā)性成分。

表2 保留指數(shù)在萬壽菊油揮發(fā)性成分鑒定中的應(yīng)用實例Table 2 Practical cases related to retention index on identifying volatile compound of the extracted oil from Tagetes Erecta L.flowers

3 結(jié)論

保留指數(shù)表示物質(zhì)在固定液上的保留值行為，具有重現(xiàn)性好、標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一及溫度系數(shù)小等優(yōu)點，是國際上對天然產(chǎn)物常用的定性方法。由于天然香原料中的化合物普遍存在一些同分異構(gòu)體或同系物，僅用質(zhì)譜庫檢索和匹配度定性會出現(xiàn)多種可能性，使化合物的定性極為困難，甚至導(dǎo)致誤判。在分析結(jié)果中，化合物保留指數(shù)相同且質(zhì)譜圖相同的概率極低。因此，保留指數(shù)法是復(fù)雜體系特別是中草藥[5，7]、香精香料[4]、食品[6]等學(xué)科分析工作中十分重要的定性依據(jù)。

本試驗從萬壽菊油中利用GC-MS可分離檢出50個組分，采用峰面積歸一化法估算各組分相對含量，結(jié)合保留指數(shù)共鑒定出39種揮發(fā)性成分，占總組分的97.99%，其中含量較高的組分為當(dāng)歸酸-3-甲基戊酯（12.58%）、異丁酸異戊酯（11.08%）、（1S）-（-）-α蒎烯（10.91%）、丁酸異丁酯（10.38%）、（Z）-2-甲基-2丁烯酸2-甲基-丙酯（9.95%）以及異丁酸-4甲基戊酯（7.79%）。本文采用GC-MS譜庫檢索結(jié)合保留指數(shù)對萬壽菊油揮發(fā)性化學(xué)成分進行結(jié)構(gòu)鑒定，較單純使用MS譜庫檢索鑒定更準(zhǔn)確。如：本試驗中丁酸戊酯、對烯丙基茴香醚、異丁酸異戊酯、桉葉油醇、丙酸己酯、（-）-反式-松香芹醇、冰片、松香芹酮、（E）-2-甲基-2丁烯酸2-甲基烯丙酯等化合物的定性須經(jīng)保留指數(shù)輔助方可確認(rèn)。本試驗分離鑒定的主要成分在種類和相對含量上與文獻報道[14-16]的有一定差異，分析原因，除了萬壽菊油原料的產(chǎn)地、采收期、存儲以及精油提取方式等因素會對原料揮發(fā)性成分造成一定的影響外，樣品前處理方式和測定方法等因素也是影響鑒定結(jié)果差異的主要原因。