國(guó)內(nèi)外結(jié)核病預(yù)防用卡介苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)比較

趙愛(ài)華 王國(guó)治 付麗麗 徐苗

卡介苗是目前唯一可用的能預(yù)防結(jié)核病的疫苗[1]，在我國(guó)是計(jì)劃免疫疫苗，1978年即納入國(guó)家免疫規(guī)劃，《國(guó)家免疫規(guī)劃兒童免疫程序及說(shuō)明(2016年版)》要求新生兒出生時(shí)接種。因此卡介苗是接種者年齡最小的疫苗，同時(shí)也是接種后異常反應(yīng)報(bào)道較多的疫苗[2-3]。國(guó)內(nèi)目前供應(yīng)計(jì)劃免疫用卡介苗的生產(chǎn)企業(yè)為上海生物制品研究所有限責(zé)任公司和成都生物制品研究所有限責(zé)任公司。兩家企業(yè)年獲得簽發(fā)總量約5千萬(wàn)人份，每年約有1千萬(wàn)名兒童接種卡介苗。近年來(lái)，聯(lián)合國(guó)兒童基金會(huì)(UNICEF)每年卡介苗需求量超過(guò)1億人份，主要由日本、丹麥、保加利亞等國(guó)家的卡介苗生產(chǎn)企業(yè)提供，其他國(guó)家如俄羅斯、巴西則主要供應(yīng)本國(guó)使用。

隨著人們對(duì)國(guó)產(chǎn)疫苗有效性與安全性的日益關(guān)注，部分民眾認(rèn)為進(jìn)口疫苗優(yōu)于國(guó)產(chǎn)疫苗，那么國(guó)產(chǎn)卡介苗與國(guó)外卡介苗在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)上是否有差異？筆者僅對(duì)國(guó)內(nèi)外卡介苗生產(chǎn)與質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行簡(jiǎn)要的分析比較，以便了解中國(guó)與國(guó)際上卡介苗質(zhì)量控制研究與發(fā)展的概況，供同行參考。

我國(guó)卡介苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)概況

制定疫苗質(zhì)量規(guī)程的目的是保證生產(chǎn)疫苗的質(zhì)量，確保疫苗安全、有效。針對(duì)計(jì)劃免疫用疫苗，世界衛(wèi)生組織(WHO)也會(huì)發(fā)布相關(guān)建議，供世界各國(guó)參考，對(duì)于卡介苗質(zhì)量其最新技術(shù)規(guī)范(WHO TRS 979)于2013年發(fā)布[4]，主要質(zhì)量控制(簡(jiǎn)稱(chēng)“質(zhì)控”)內(nèi)容包括種子批質(zhì)控、生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)控及成品質(zhì)控。我國(guó)卡介苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考《中國(guó)人民共和國(guó)藥典(2015年版)》[5]，同時(shí)執(zhí)行皮內(nèi)注射用卡介苗2個(gè)局頒標(biāo)準(zhǔn)，分別為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)WS 4-(ZB-010)-2010和WS 4-(ZB-004)-2010，也是上海與成都生物制品研究所有限公司的企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，2個(gè)國(guó)家局頒布標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控項(xiàng)目與藥典項(xiàng)目完全一致。我國(guó)卡介苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)基本涵蓋了世界衛(wèi)生組織建議的相關(guān)內(nèi)容，下面具體分析種子批質(zhì)控、生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)控及成品質(zhì)控方面與歐洲藥典[6]的差異。

一、種子批質(zhì)控的差異

對(duì)于種子批質(zhì)控，WHO卡介苗推薦項(xiàng)目包括鑒別試驗(yàn)、3項(xiàng)安全性試驗(yàn)(細(xì)菌和真菌污染檢查、無(wú)有毒分枝桿菌試驗(yàn)、過(guò)度皮膚反應(yīng)試驗(yàn))，1項(xiàng)效力試驗(yàn)(遲發(fā)超敏反應(yīng))、1項(xiàng)菌株特性試驗(yàn)(抗生素敏感性)，共6項(xiàng)。我國(guó)藥典含鑒別試驗(yàn)、3項(xiàng)安全性試驗(yàn)(純菌檢查、毒力試驗(yàn)、無(wú)有毒分枝桿菌試驗(yàn))，1項(xiàng)效力試驗(yàn)(免疫力試驗(yàn))，共5項(xiàng)。歐洲藥典僅鑒別試驗(yàn)與2項(xiàng)安全性試驗(yàn)項(xiàng)目(細(xì)菌和真菌污染檢查、無(wú)有毒分枝桿菌試驗(yàn))，共3項(xiàng)。主要差異在于效力試驗(yàn)歐洲藥典不涉及，WHO推薦采用細(xì)胞免疫反應(yīng)標(biāo)志的結(jié)核菌素遲發(fā)超敏反應(yīng)作為效力指標(biāo)，中國(guó)藥典采用結(jié)核分枝桿菌攻毒后BCG免疫動(dòng)物臟器荷菌量的降低作為效力指標(biāo)。結(jié)核菌素試驗(yàn)是無(wú)論結(jié)核分枝桿菌感染、卡介苗接種或非結(jié)核分枝桿菌感染都顯示陽(yáng)性的試驗(yàn)，一是無(wú)特異性，二是該指標(biāo)為非疫苗誘導(dǎo)抗結(jié)核保護(hù)力的直接指標(biāo)，只能提示卡介苗免疫成功。而中國(guó)藥典采用的動(dòng)物抗結(jié)核分枝桿菌攻擊的評(píng)價(jià)方式能直接顯示種子批誘導(dǎo)的抗結(jié)核免疫力水平，多年來(lái)給更換的種子批進(jìn)行的保護(hù)力評(píng)價(jià)，結(jié)果基本一致[7]。另外歐洲藥典9.0版是從2017年開(kāi)始執(zhí)行，對(duì)于WHO建議的抗生素敏感性試驗(yàn)，雖然未列入種子批項(xiàng)目，但也要求對(duì)該項(xiàng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。我國(guó)藥典尚未設(shè)置該項(xiàng)檢測(cè)；但中國(guó)食品藥品檢定研究院(簡(jiǎn)稱(chēng)“中檢院”)的評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，我國(guó)卡介苗菌種的抗生素敏感性與其相同來(lái)源的丹麥菌種(BCG Danish1331)一致(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。具體的國(guó)內(nèi)外種子批質(zhì)控項(xiàng)目差異見(jiàn)表1。

二、生產(chǎn)過(guò)程質(zhì)控項(xiàng)目的差異

對(duì)于生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)控，WHO卡介苗推薦項(xiàng)目包括濃度測(cè)定、活菌數(shù)測(cè)定，還包括2項(xiàng)安全性試驗(yàn)(細(xì)菌和真菌污染檢查、無(wú)有毒分枝桿菌試驗(yàn))，共4項(xiàng)。歐洲藥典與我國(guó)藥典均不在生產(chǎn)過(guò)程中涉及無(wú)有毒分枝桿菌試驗(yàn)。

眾所周知卡介苗的不良反應(yīng)與疫苗本身的濃度、均勻度與活菌量有關(guān)。卡介苗的生產(chǎn)首先是菌種復(fù)蘇，其次是菌體傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，以收集足夠的菌體用于菌液的制備。但由于卡介苗的疏水特性，因此其培養(yǎng)的菌體浮于液體培養(yǎng)基的表面，形成一層菌膜，收集菌體后需要將這些菌膜研磨成小的菌塊，形成均勻的菌液后再稀釋分裝。若收集的菌體研磨不均勻，則會(huì)導(dǎo)致制品中含有大量的菌塊，臨床接種后可能導(dǎo)致不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)的增加。因此，我國(guó)藥典設(shè)置了沉降率項(xiàng)目，通過(guò)評(píng)價(jià)沉降率大小，間接了解菌液的均勻性。同時(shí)與濃度指標(biāo)、活菌數(shù)指標(biāo)同時(shí)控制，避免由于菌塊過(guò)大、菌體過(guò)多、活菌數(shù)過(guò)高而導(dǎo)致的臨床接種不良反應(yīng)，這是在生產(chǎn)過(guò)程中從疫苗因素本身來(lái)避免發(fā)生臨床不良反應(yīng)的質(zhì)控措施。我國(guó)藥典在半成品項(xiàng)下還設(shè)置了活力測(cè)定項(xiàng)目，主要基于卡介苗半成品至成品分裝周期短，同時(shí)活菌數(shù)檢測(cè)周期需要4～5周的現(xiàn)狀，采用生物化學(xué)方法短時(shí)間內(nèi)獲得制品的活菌狀況。WHO推薦規(guī)范僅將該項(xiàng)目置于成品項(xiàng)下(表1)。

三、成品質(zhì)控項(xiàng)目的差異

對(duì)于成品質(zhì)控，WHO推薦項(xiàng)目含9項(xiàng)，歐洲藥典5項(xiàng)，中國(guó)藥典8項(xiàng)，但具體檢測(cè)項(xiàng)目中國(guó)藥典有10項(xiàng)。國(guó)外藥典與中國(guó)藥典主要的質(zhì)控項(xiàng)目的差異在于過(guò)度皮膚反應(yīng)，該項(xiàng)目同樣涉及種子批的檢定，并說(shuō)明工作種子批及來(lái)自本工作種子批連續(xù)五批或三批成品該項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均合格，則成品此項(xiàng)檢測(cè)可省略。推測(cè)設(shè)置該項(xiàng)目的目的可能是考察菌種及其所制備疫苗接種后導(dǎo)致不良反應(yīng)的程度。中檢院曾對(duì)我國(guó)卡介苗生產(chǎn)用工作種子批，國(guó)內(nèi)兩家卡介苗企業(yè)生產(chǎn)的47批疫苗成品進(jìn)行了該項(xiàng)目的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)我國(guó)皮內(nèi)注射用卡介苗菌種工作種子批和成品的過(guò)度皮膚反應(yīng)直徑及活菌數(shù)與國(guó)家參考品無(wú)差異；同時(shí)我國(guó)卡介苗制品的過(guò)度皮膚反應(yīng)程度也低于國(guó)外疫苗制品，推斷過(guò)度皮膚反應(yīng)與菌種、濃度、均勻度及活菌數(shù)都有關(guān)；在確定菌種的情況下，可能與疫苗制造過(guò)程中顆粒大小的均勻度、濃度及活菌數(shù)的關(guān)聯(lián)性更大；我國(guó)卡介苗生產(chǎn)規(guī)程通過(guò)對(duì)濃度、沉降率、活菌數(shù)的控制，可以從生產(chǎn)過(guò)程中控制成品引起皮膚反應(yīng)的程度。因此，過(guò)度皮膚反應(yīng)試驗(yàn)?zāi)壳霸谖覈?guó)卡介苗生產(chǎn)規(guī)程中設(shè)置的意義并不大。

表1 國(guó)內(nèi)外卡介苗質(zhì)控項(xiàng)目的差異

注“-”代表該藥典或規(guī)范中不做此項(xiàng)檢定

卡介苗是活菌疫苗，活菌易受到環(huán)境溫度的影響而導(dǎo)致活菌數(shù)改變，進(jìn)而影響疫苗的質(zhì)量；因此，要對(duì)制品進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)疫苗的穩(wěn)定性。我國(guó)熱穩(wěn)定標(biāo)準(zhǔn)為25%，即在37 ℃條件下放置28 d進(jìn)行加速破壞試驗(yàn)樣品的活菌數(shù)與2～8 ℃保存的同一批疫苗活菌數(shù)比較不得低于25%，并不得低于2.5×105菌落形成單位(CFU)/mg。國(guó)外的熱穩(wěn)定標(biāo)準(zhǔn)為20%[5]。我國(guó)藥典對(duì)卡介苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于卡介苗活菌數(shù)僅設(shè)置了下限，即不低于1.0×106CFU/mg。而目前企業(yè)設(shè)置的放行標(biāo)準(zhǔn)在2.0×106CFU/mg以上；檢定機(jī)構(gòu)在疫苗上市前的批簽發(fā)過(guò)程中，設(shè)置上下警戒限在2.0×106CFU/mg～8.0×106CFU/mg ，以確保制品的批間一致性。

通過(guò)上述國(guó)內(nèi)外卡介苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的比較，可見(jiàn)WHO技術(shù)規(guī)范(WHO TRS 979)推薦更多的安全性檢測(cè)，但從項(xiàng)目設(shè)置中國(guó)藥典涵蓋了世界衛(wèi)生組織的技術(shù)規(guī)范(WHO TRS 979)的大部分內(nèi)容，而歐洲藥典則相對(duì)較少。

我國(guó)卡介苗菌種概況

菌種是影響卡介苗有效性與安全性的最主要因素，卡介苗是一株牛分枝桿菌經(jīng)過(guò)13年230余代連續(xù)培養(yǎng)獲得的減毒株，自1921年應(yīng)用于人體后，卡介苗原始菌株被分發(fā)到全球各地，經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)室、不同傳代方式，形成了培養(yǎng)特性、遺傳特性各不相同的10余種疫苗生產(chǎn)株。國(guó)際上應(yīng)用較多的疫苗生產(chǎn)用菌種包括，法國(guó)巴斯德株(BCG Pasteur 1173 P2)，丹麥1331株(BCG Danish 1331)，巴西株(BCG Mearou-RJ)，俄羅斯株(BCG Moscow 368)，保加利亞株(BCG Sofia SL 222)和日本172株(BCG Tokyo-172-1)等。我國(guó)現(xiàn)用卡介苗生產(chǎn)用菌種，源自1948年引進(jìn)的共傳了823代的丹麥菌種(BCG Danish 823)，該菌株經(jīng)北京、上海、蘭州培養(yǎng)后發(fā)生變異，形成上海D2株、北京D1株及蘭州株(D2L)等，其中上海D2株于1974年12月29日凍干保存，稱(chēng)為BCG D2 PB302SⅡ甲10菌株，即現(xiàn)在計(jì)劃免疫卡介苗的生產(chǎn)株，1993年全國(guó)統(tǒng)一使用BCG D2 PB302SⅡ甲10菌株生產(chǎn)卡介苗。

一、我國(guó)卡介苗菌種遺傳學(xué)特性與國(guó)外菌種的差異

國(guó)際上不同卡介苗亞株的遺傳特性各不相同[8]，我國(guó)卡介苗菌種為BCG Danish 823 傳代菌種，與目前廣泛應(yīng)用的BCG Danish 1331在遺傳學(xué)特性上有差異。我國(guó)卡介苗菌種同所有其他卡介苗亞株相同，都特異性缺失卡介苗在減毒過(guò)程中的缺失序列RD1，與BCG Danish 1331一樣都缺失RD2，不缺失RD8、RD14、RD16、nRD18，含有一個(gè)IS 6110插入序列，但不同于BCG Danish 1331，含有RDDenmark/Glaxo 序列；SenX3-RenX3 基因座有3個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，而B(niǎo)CG Danish 1331 含有2個(gè)或3個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列[9-10]，同時(shí)我國(guó)菌種與BCG Pasteur 1173 P2及BCG Tokyo-172-1有更明顯的差異,其中日本株中含有2個(gè)亞型[11]。

從丹麥株和日本株的遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果可以了解其菌株中含2個(gè)亞型，說(shuō)明菌種不均一。早在20世紀(jì)70年代，Dam 等[12]就指出雖然各國(guó)制造BCG菌株均來(lái)源于法國(guó)巴斯德研究所，但由于當(dāng)初的菌株不是采自單株菌落，而是混合菌落，因此使各菌株間在免疫力及減毒方面不可避免地會(huì)有一定程度的差異，同時(shí)也說(shuō)明了傳代對(duì)菌株的影響。目前，世界上的上市疫苗的菌種均是復(fù)合菌種；為減少傳代代次對(duì)卡介苗效力的影響，并且使卡介苗疫苗生產(chǎn)管理更規(guī)范化，應(yīng)該了解復(fù)合菌種與其中的不同單細(xì)胞克隆菌種在保護(hù)力方面的差異。2009年中國(guó)食品藥品檢定研究院將我國(guó)早期1956年凍干的卡介苗菌種進(jìn)行復(fù)蘇并擴(kuò)增傳代，其國(guó)內(nèi)外總計(jì)傳代944代，2014年以微孔濾膜方式從中制備單細(xì)胞克隆系列共5株，根據(jù)單細(xì)胞克隆菌落的培養(yǎng)特性與遺傳學(xué)特性，進(jìn)行動(dòng)物抗結(jié)核感染的保護(hù)效果篩選，獲得目前唯一的一株單細(xì)胞克隆生產(chǎn)用菌種，由該菌種生產(chǎn)的卡介苗已獲得藥物臨床批件。

二、我國(guó)卡介苗菌種動(dòng)物保護(hù)力與國(guó)外菌種的差異

盡管卡介苗已經(jīng)有百年應(yīng)用歷史，但迄今缺少系統(tǒng)的、不同卡介苗菌株人體保護(hù)力的比較研究資料；在無(wú)人體使用效果的相關(guān)數(shù)據(jù)情況下，動(dòng)物保護(hù)力成了菌株保護(hù)力的主要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。

早在20世紀(jì)50年代，我國(guó)就在開(kāi)展的卡介苗菌種篩選工作中，比較了我國(guó)卡介苗與國(guó)外菌株動(dòng)物保護(hù)力的差異。選擇卡介苗免疫后感染結(jié)核分枝桿菌的小鼠存活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)了包括上海 D2株、北京D1株、巴西株、巴斯德株、蘇聯(lián)株、匈牙利株在內(nèi)的8株卡介苗菌株。結(jié)果顯示上海 D2株保護(hù)效果最佳，保護(hù)力優(yōu)于其他菌株，平均存活率為56.0%，匈牙利株保護(hù)力最低，平均存活率僅16.0%[13]。

近年又采用豚鼠模型評(píng)價(jià)我國(guó)的BCG D2 PB302與丹麥株(BCG Danish 1331)、巴斯德株(BCG Pasteur 1173 P2)、布拉格株(BCG Prague)及匈牙利株(BCG Hungary)的動(dòng)物保護(hù)力差異， 結(jié)果與20世紀(jì)50年代的結(jié)果一致，匈牙利株的保護(hù)力最低，而B(niǎo)CG D2 PB302呈現(xiàn)優(yōu)良保護(hù)力，與BCG Danish 1331、BCG Pasteur 1173等其他亞株保護(hù)效果基本一致。該實(shí)驗(yàn)與早期小鼠模型試驗(yàn)間隔近60年，但結(jié)果完全一致[14]。

我國(guó)卡介苗接種現(xiàn)狀

由于《預(yù)防接種工作規(guī)范(2016年版)》并不要求進(jìn)行PPD陽(yáng)轉(zhuǎn)率的卡介苗免疫效果評(píng)價(jià)[15]，因此我國(guó)并無(wú)大規(guī)?？ń槊缃臃N效果考核數(shù)據(jù)。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我國(guó)卡介苗接種覆蓋率高，可達(dá)90%以上，接種3個(gè)月后PPD陽(yáng)轉(zhuǎn)率通常達(dá)90%，甚至95%[16-18]；說(shuō)明我國(guó)卡介苗接種后能誘導(dǎo)很好的免疫反應(yīng)；同時(shí)在技術(shù)熟練的接種人員進(jìn)行操作的情況下，不良反應(yīng)也并不常見(jiàn)。筆者參與的一項(xiàng)對(duì)近3萬(wàn)名新生兒進(jìn)行卡介苗接種的臨床研究顯示，接種人員經(jīng)過(guò)培訓(xùn)后接種，PPD陽(yáng)轉(zhuǎn)率高達(dá)97%，發(fā)生不良反應(yīng)者僅19例，其中11例為卡介苗特異性的淋巴結(jié)反應(yīng)[19-20]。根據(jù)我國(guó)多年來(lái)疑似預(yù)防接種異常反應(yīng)(adverse events following immunization，AEFI)的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)卡介苗淋巴結(jié)反應(yīng)發(fā)生率為15.1/100萬(wàn)劑～54.43/100萬(wàn)劑[21-23]，低于WHO估測(cè)的卡介苗化膿性淋巴結(jié)炎發(fā)生率范圍(1/萬(wàn)～10/萬(wàn))[24]。

小 結(jié)

以上分析可見(jiàn)，我國(guó)有自己的卡介苗生產(chǎn)用菌種；我國(guó)卡介苗動(dòng)物保護(hù)效果與國(guó)際常用菌株基本一致；有可以生產(chǎn)卡介苗的生產(chǎn)企業(yè)，能自主生產(chǎn)并提供每年5千萬(wàn)人份的疫苗。我國(guó)卡介苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)控制產(chǎn)品與不良反應(yīng)相關(guān)的安全性標(biāo)準(zhǔn)，如濃度、均勻度、半成品活力、異常毒性實(shí)驗(yàn)等指標(biāo)均高于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，在有效性指標(biāo)中我國(guó)對(duì)卡介苗在工作種子批的評(píng)價(jià)采用更為嚴(yán)格的成品動(dòng)物感染保護(hù)力評(píng)價(jià)指標(biāo)；在活菌熱穩(wěn)定性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)上，國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)較WHO的推薦標(biāo)準(zhǔn)高；我國(guó)生產(chǎn)的卡介苗接種后能誘導(dǎo)很好的免疫反應(yīng)，不良反應(yīng)在正常范圍內(nèi)；上述這些情況，都是我國(guó)不選用進(jìn)口卡介苗的原因。由于卡介苗接種人群的特殊性，檢定機(jī)構(gòu)應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注卡介苗質(zhì)量，還需不斷地修訂相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步提高我國(guó)衛(wèi)生健康與結(jié)核病防治的服務(wù)水平。