大孔樹脂富集純化阿夏塞爾郡總黃酮的工藝研究*

澤仁達(dá)瓦 林朝展

（1.西藏藏醫(yī)學(xué)院科研處，西藏 拉薩 850002；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所，廣東 廣州 510405）

藏藥“阿夏塞爾郡”又名打箭菊，為菊科匹菊屬植物川西小黃菊 Pyrethrum tatsienense（Bur.et Franch.）Ling的干燥地上部分［1］。性寒，味苦，無(wú)毒。具有活血、散癖、祛濕、消炎、止痛功能。文獻(xiàn)報(bào)道打箭菊中主要含有木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、洋芹素、芫花素等黃酮類成分［2］。大孔吸附樹脂是一類有機(jī)高聚物吸附劑，具有高選擇性、高機(jī)械強(qiáng)度、高穩(wěn)定性、大載樣量、以及再生處理簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)［3］，在醫(yī)藥領(lǐng)域（特別是天然藥物純化）中廣為應(yīng)用，是分離純化中藥有效成分的一種常用方法［4］。其中AB-8大孔樹脂屬于快速吸附樹脂，吸附量和解吸率都較高，是理想的適用于中藥總黃酮吸附分離的樹脂類型［5-7］。此實(shí)驗(yàn)旨在探討AB-8型大孔樹脂富集阿夏塞爾郡總黃酮的工藝流程與參數(shù)，同時(shí)建立阿夏塞爾郡總黃酮相應(yīng)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器、材料和試劑

1.1 儀器

HEWLETT PACKARD-6010紫外-可見分光光度計(jì)（美國(guó)Agilent公司），Satorius QUINTIX65-1CN十萬(wàn)分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 材料

阿夏塞爾郡樣品，2014年6月采自西藏林芝地區(qū)，經(jīng)西藏藏醫(yī)學(xué)院康薩·索朗其美教授鑒定學(xué)名為菊科匹菊屬植物川西小黃菊Pyrethrum tatsienense（Bur.et Franch）Ling，憑證標(biāo)本（PT-201406）現(xiàn)保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)臨床藥理研究所。AB-8型大孔吸附樹脂（天津南開大學(xué)化工廠），蘆丁對(duì)照品，其結(jié)構(gòu)經(jīng)IR、MS和NMR波譜鑒定，純度經(jīng)HPLC面積歸一化法計(jì)算均在98%以上，均為此實(shí)驗(yàn)自制。

1.3 試劑

冰醋酸、乙醇，均為AR級(jí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取蘆丁5.0 mg，精密稱定，置20mL容量瓶中，加乙醇溶解，并定容至刻度，搖勻，即得蘆丁對(duì)照品溶液（0.286mg/mL）。精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0.1，0.4，0.8，1.2，2.0，3.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，各加乙醇至6mL，再加0.5mL 2%三氯化鋁乙醇溶液（含1%冰醋酸），加乙醇至刻度，搖勻，放置1 h，以乙醇為空白對(duì)照，在275 nm下測(cè)定各溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)（y），濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，并得到回歸方程：y=0.0341x+0.0023(r=0.9997），線性范圍：1.14-34.32 μg/mL。

2.2 供試品溶液的制備

取打箭菊藥材粉末約20 g，精密稱定，分別加入20倍量、15倍量80%乙醇，加熱回流提取2次，合并2次提取液，減壓濃縮，揮干，用乙醇適量溶解，過(guò)濾，濾液定容至100mL，即得。測(cè)定總黃酮含量（紫外分光光度法：取1mL打箭菊供試品溶液，各加乙醇至6mL，再加0.5 mL 2%三氯化鋁乙醇溶液（含1%冰醋酸），用乙醇稀釋定容至25mL，搖勻，放置60min，在275nm下測(cè)定吸光度，測(cè)得結(jié)果見表1，隨行標(biāo)曲為y=0.031x+0.048(r=1)。

表1 打箭菊中總黃酮的含量

2.3 大孔樹脂工藝參數(shù)考察

2.3.1 大孔樹脂預(yù)處理與裝柱。稱取AB-8大孔樹脂7 kg（濕重），用95%乙醇浸泡12小時(shí)，濕法裝柱（d=15cm，h=52cm，V=9 L）。然后用95%乙醇洗脫雜質(zhì)，控制流速為2 mL/min，洗至1 mL洗脫液與3 mL蒸餾水混合不出現(xiàn)白色混濁為止，再用蒸餾水平衡柱子，至樹脂排列均勻、無(wú)氣泡、洗脫液無(wú)醇味時(shí)即可。

2.3.2 吸附容量的確定。吸取上述提取液50 mL，揮干，用蒸餾水適量溶解成混懸液，濕法上樣于大孔樹脂柱（10 g濕法裝柱于10 mm×50 mm柱中，柱體積BV=15 mL）。收集過(guò)柱液，平行3份，測(cè)定其中總黃酮含量，過(guò)柱液反復(fù)上柱，直到其吸光度值不再變化，測(cè)定最后一次收集的過(guò)柱液中總黃酮含量。上樣液中總黃酮含量=上樣液中總黃酮的量/上樣液干膏重。

表2 吸附容量的確定*

2.3.3 乙醇濃度的確定。取樣品液50 mL，按“2.3.2”項(xiàng)上柱后，先用蒸餾水洗脫10個(gè)柱體積，分別再用30%乙醇和70%乙醇各10個(gè)柱體積洗脫，洗脫液流速為1.5 mL/min-1，每10 mL收集一個(gè)流份，依次編號(hào)為1、2、3…36。精密吸取1 mL打箭菊供試品溶液，各加乙醇至6 mL，再加0.5 mL 2%三氯化鋁乙醇溶液（含1%冰醋酸），用乙醇稀釋定容至25 mL，搖勻，放置60 min，在275 nm下測(cè)定吸光度。以流份編號(hào)為橫坐標(biāo)（X），以總黃酮含量為縱坐標(biāo)（Y）繪制洗脫曲線。分別收集蒸餾水洗脫液、30%乙醇洗脫液、70%乙醇洗脫液，進(jìn)行減壓濃縮、干燥，稱其干膏重，計(jì)算打箭菊總黃酮的含量，見表3。

表3 打箭菊總黃酮在不同洗脫液中的含量

從上表中可看出，蒸餾水洗脫出來(lái)的總黃酮為34.84 mg，其干膏中總黃酮含量占11.85%；30%的乙醇洗脫出來(lái)的總黃酮為84.95 mg，其干膏中總黃酮含量占66.38%；70%乙醇洗脫的總黃酮為40.94 mg，其干膏中總黃酮含量占14.15%.其中70%乙醇洗脫液干膏重比30%的乙醇洗脫液干膏重多，但總黃酮含量較少，因此30%的乙醇洗脫效果優(yōu)于70%乙醇洗脫效果。

2.3.4 洗脫劑的確定。由表4的數(shù)據(jù)可知，當(dāng)30%乙醇洗脫到第18號(hào)接收瓶，即洗脫12個(gè)柱體積時(shí)，總黃酮基本洗脫出來(lái)，故確定溶媒用量為180 mL，約為12個(gè)柱體積。

表4 30%乙醇的洗脫曲線表

2.3.5 重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按最優(yōu)化條件，精密吸取打箭菊樣品液20 mL上柱，依次用12個(gè)柱體積的蒸餾水和12個(gè)柱體積30%乙醇洗脫，收集30%乙醇洗脫液，平行3份，測(cè)定30%乙醇洗脫液中總黃酮含量，另取20 mL打箭菊上柱樣品液與30%乙醇洗脫液分別水浴揮干，烘箱恒重，計(jì)算總固物，結(jié)果見表5。

表5 重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3 討論

此課題組前期從打箭菊的甲醇提取物中分離并鑒定出14個(gè)黃酮類化合物［1］，表明黃酮類化合物是打箭菊的主要成分類群，因此，摸索出穩(wěn)定可靠的打箭菊總黃酮提取精制工藝，為后續(xù)研究提供有力支撐。

此實(shí)驗(yàn)采用AB-8型大孔樹脂研究精制、純化打箭菊總黃酮的工藝條件及參數(shù)。以打箭菊總黃酮洗脫率和含量為考察指標(biāo)，對(duì)大孔樹脂的吸附容量、洗脫劑的乙醇濃度、洗脫劑量進(jìn)行考察。結(jié)果為AB-8型大孔樹脂對(duì)打箭菊總黃酮的吸附容量為18.02 mg/g樹脂；以30%乙醇為洗脫劑效果最佳；洗脫劑用量為180mL約12個(gè)柱體積。用30%乙醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，可使打箭菊總黃酮的精制度達(dá)到500%以上，30%乙醇洗脫液中總固物中總黃酮含量達(dá)62.4%以上，與純化前相比明顯提高，富集效果較好，該工藝操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可作為打箭菊總黃酮有效的富集方法，在中藥有效成分分離、富集工藝中有一定的推廣價(jià)值。