王雪艷，黃艷萍，楊 瑩，許劍怡，王宏娟，唐旭東*

（1.深圳清華大學(xué)研究院創(chuàng)新中藥及天然藥物研究重點實驗室，深圳，廣東，5518000 2. 深圳清華大學(xué)研究院-華研共建皮膚健康研究中心，深圳，廣東，518000）

蟲草素（3’-脫氧腺苷）是一種具有多種生物學(xué)功能的核苷類抗菌素[1]，具有明確的抗微生物[2]、抗腫瘤、抗突變、抗轉(zhuǎn)移[3]、抗血管生成、抗真菌、抗糖尿 病、抗 炎、抗 血 小板凝集[4]、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等作用[5]。最近研究成果表明：蟲草素通過調(diào)節(jié)泌乳素分泌，參與調(diào)節(jié)細胞增殖與分化、毛囊周期、免疫應(yīng)答等生理過程，從而產(chǎn)生干預(yù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬皮病、白塞病、干燥綜合癥、銀屑病等免疫相關(guān)皮膚病的作用[6,7]，在皮膚病藥物外用制劑、功效性化妝品等應(yīng)用開發(fā)領(lǐng)域，是明確地具有開發(fā)前景的一類化合物。

透皮給藥系統(tǒng)是指使藥物以一定的速率通過皮膚，經(jīng)毛細血管吸收，進入人體循環(huán)而達到產(chǎn)生藥效的一類制劑，與傳統(tǒng)給藥方式相比，具有避免肝臟“首過效應(yīng)”的優(yōu)點。但由于皮膚角質(zhì)層的阻礙，藥物難以透過皮膚發(fā)揮治療作用。因此根據(jù)藥物特征，促滲技術(shù)的篩選和優(yōu)化，是透皮給藥系統(tǒng)研究的重點領(lǐng)域，常見促滲技術(shù)有：化學(xué)促滲、微針、皮下注射、無針注射、離子導(dǎo)入、超聲波、電致孔等[8]。

本文采用Franz透皮給藥系統(tǒng)，考察微針和化學(xué)促滲劑兩種促滲方式，對促進蟲草素透過角質(zhì)層的影響，計算單位面積累積滲透量Qn、穩(wěn)態(tài)滲透常數(shù)Jass、建立滲透模型，為含有蟲草素的外用制劑（例如藥物外用制劑、功能性化妝品）等的開發(fā)，特別是給藥形式等，提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑、儀器

雄性SD 大鼠，體重180-200g，6 周齡，中國人民解放軍醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SCXK2015-0001

蟲草素對照品( 批號10040422 上海源葉生物科技有限公司; 蟲草素( HPLC純度＞ 98%，本室合成) ; 甲醇(色譜純，BCR)；氮酮（藥用級，阿拉?。淮姿? Fisher Chemicals)；SA-2100E1制水機（日本EYEle）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉( 國藥集團化學(xué)試劑有限公司，分析純)

TT-6(D)透皮擴散試驗儀(天津市正通科技有限公司)；島津20A高效液相色譜儀（日本島津）；SCQ-超聲波清洗器( 上海聲彥超聲波儀器有限公司)；AG-135型電子分析天平( 瑞士Mettler-Toledo)；DL-Z 型納米晶片(高度為150 μm ,蘇州納通生物納米技術(shù)有限公司）

1.2 方 法

1.2.1 蟲草素方法學(xué)考察 色譜條件：色譜柱TC-C18（4.6×250mm，5μm），流動相甲醇：水=20:80，柱溫30℃，流速1.0ml/min，檢測波長，進樣量 10μL。

標準曲線：取蟲草素對照品5 mg，精密稱定，置50 mL 棕色量瓶中，用磷酸鹽緩沖液( PBS，pH 7.4) 超聲至溶解，并稀釋至刻度，即得濃度為100 mg/L的蟲草素對照品儲備液。精密量取一定量的對照品儲備液，用PBS稀釋為系列濃度對照品溶液（0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L）。對照品溶液10μL進樣，以濃度C為橫坐標，峰面積A為縱坐標，建立回歸方程，并考察線性范圍。

精密度：取1.0 mg/L 的蟲草素對照品溶液，采用1.2.1項下色譜條件重復(fù)進樣6次，進樣量10μL，計算峰面積相對標準偏差RSD。

穩(wěn)定性：取1.0mg/L的蟲草素對照品溶液，采用1.2.1項下色譜條件，分別在0，4，8，12，16，24h進樣，進樣量10μL，計算峰面積相對標準偏差RSD。

回收率：取已知濃度的12 h 空白對照組透皮接收液0.5mL，分別精密加入1.0 mg/L的蟲草素對照品溶液，充分混勻后，平行制備6份，采用1.2.1項下色譜條件，進樣量10μL，計算平均回收率。

1.2.2 體外透皮實驗 離體鼠皮制備：大鼠處死后，取腹部皮膚，刮去鼠毛并除去脂肪等，生理鹽水清潔，分割成大小相等的小塊，冷藏備用（過程中注意保留完整角質(zhì)層）。

微針預(yù)處理：平鋪1.2.2項下制備的鼠皮，角質(zhì)層朝上，用150μm的微針在1 N 的壓力下垂直作用于鼠皮，按壓微針順皮膚紋理滯留1 min 后移走，鼠皮冷藏備用。

透皮實驗：將大小相等的鼠皮和微針預(yù)處理后鼠皮，分別固定在滲透擴散裝置的擴散池與接收池之間，角質(zhì)層面向擴散池，真皮層面向接收池，在接收池中注入接收液 ( PBS，pH7.4) 約7 mL，在擴散池分別加入空白溶液（PBS溶劑）、蟲草素組（500mg/mL，PBS溶劑）、 微針預(yù)處理組（蟲草素濃度500mg/mL，PBS溶劑，微針預(yù)處理鼠皮）、氮酮組（蟲草素濃度500mg/mL，0.2%氮酮，PBS溶劑），水浴37℃，磁力轉(zhuǎn)子恒速300r/min。分別于0.5、1、2、4、8、12、24h取樣，取樣量0.5ml。取樣后，補加接收液至刻度。樣品按2.1.1項下方法測定蟲草素含量。

1.3 計 算

采用公式1,計算單位面積累積滲透量。以單位面積累積滲透量(Q,μg/cm2) 對滲透時間t進行線性擬合，取得滲透動力學(xué)公式，

其中：曲線斜率為穩(wěn)態(tài)滲透速率常數(shù)（J，μg/cm2·h）、微針或滲透劑處理后與未處理藥物在24h內(nèi)的透皮速率常數(shù)之比為增滲倍數(shù)（ER），曲線與t軸交點為滯后時間（Tlag，h）

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS statistic 17.0統(tǒng)計軟件處理。兩兩之間的比較采用t 檢驗，P＜0.01認為有顯著性差異。

圖1 蟲草素液相色譜圖

圖2 蟲草素單位面積滲透累積量曲線

公式中，Qn為第n個取樣點的單位面積滲透量，A 為有效經(jīng)皮吸收面積，V 為接受液體積， V0 為取樣體積，Cn 為第 n 個取樣點測得的接受液中蟲草素濃度，Ci 為第 i個取樣點測得的接受液中蟲草素濃度( i≤n-1) 。

2 結(jié) 果

2.1 蟲草素含量測定方法學(xué)考察結(jié)果

蟲草素液相色譜圖如圖1所示。系列濃度蟲草素對照品濃度C對峰面積A作圖，線性回歸方程為A = 55.624C- 6.109（R2=0.9999），線性范圍0.100-28. 8 mg/L，線性關(guān)系良好；精密度RSD為0.278（n=6）；24h內(nèi)穩(wěn)定性RSD為0.334（n=6）；平均回收率為98.72%，RSD為0.38%（n=6）。該方法儀器精密度符合要求，穩(wěn)定性良好，回收率達到標準，可用于蟲草素的含量測定。

2.2 兩種促滲方式對蟲草素透皮單位面積累積滲透量的影響

對比微針組、氮酮組、蟲草素組24h內(nèi)，透皮的單位面積累積滲透量結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明：微針處理組、氮酮組后，從0.5h-24h，單時間點單位面積累積滲透量均高于蟲草素組，且均存在顯著性差異量（P＜0.01）。兩種促滲方式，存在組建差異（P＜0.05），但差異不顯著。蟲草素單位面積累積滲透量值如表1所示。

2.3 兩種促滲方式促進蟲草素透皮模型研究

取24h內(nèi)，滲透時間(t)對蟲草素的單位面積累積滲透量(Q)進行擬合，如圖2所示。結(jié)果表明：單位面積累積滲透量與時間呈線性關(guān)系，符合零級動力學(xué)。穩(wěn)態(tài)滲透速率常數(shù)J如表2所示。微針組和促滲劑組與蟲草素組相比，增滲倍數(shù)分別為1.916及1.720；三組的滯后時間分別為0.248 6、0.445 0、0.166 9h。

表1 蟲草素單位面積累積滲透量(n=3)

表2 兩種促滲方式的透皮模型考察

3 討 論

微針預(yù)處理和促滲劑（0.2%氮酮）均能顯著促進蟲草素透皮吸收（P＜0.01），透皮行為均為零級動力學(xué)模型。兩組間存在差異，差異不顯著（P＜0.05），但單點微針預(yù)處理組均優(yōu)于促滲劑組。

氮酮透皮的原理主要為（1）促進藥物經(jīng)表皮細胞間隙和毛囊途徑；（2）與角質(zhì)細胞內(nèi)基質(zhì)相互作用，液化細胞內(nèi)脂質(zhì)使擴散阻力降低；（3）增加皮膚角質(zhì)層含水量，增加藥物在角質(zhì)層儲庫，促進水溶性物質(zhì)經(jīng)水性通道滲透[9]。目前，以氮酮為代表的化學(xué)促滲劑烴、酮、酰胺和亞砜等有機化合物，在藥品、化妝品中應(yīng)用已非常廣泛，其易滲透進入皮膚，但存在皮膚刺激和炎癥反應(yīng)。研究表明氮酮對小鼠皮膚有刺激作用，還可與某些物質(zhì)形成絡(luò)合物，影響藥物作用，且凡士林和液體石蠟等疏水性介質(zhì)對其活性有影響[10-12]。

微針透皮能有效促進藥物的皮膚滲透，具有皮下注射和透皮給藥的雙重優(yōu)勢，可以通過微針物理性刺穿皮膚的角質(zhì)層，形成微小通道，具有顯著的促滲效果，同時不產(chǎn)生痛感，近年來已廣泛應(yīng)用于各類藥物及高檔化妝品中[13-14]。與促滲劑比較，微針不與藥物及介質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，也不一產(chǎn)生皮膚刺激和炎癥反應(yīng)，且可以通過調(diào)節(jié)微針長度和預(yù)處理方式（壓力、作用時間等）控制通道的大小和深度，進而影響滲透效率，有利于個性化給藥。

針對蟲草素透皮，微針預(yù)處理和氮酮均能達到顯著促進滲透的作用，且微針略好于氮酮，但由于機理方面的顯著差別，因而使用具有明顯的特點：前者皮膚刺激性小，且可以個性化控制，但需要借助額外的工具（晶片微針等）；后者使用方面，但可能會帶來皮膚刺激作用。因此，針對含有蟲草素的藥物外用制劑、化妝品的應(yīng)用開發(fā)方面，建議根據(jù)具體使用場景予以選擇，發(fā)揮最大功效。