魏園園

（遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽(yáng) 110164）

分子檢測(cè)方法由于具有的高敏感性、高通量和適合的價(jià)格，越來(lái)越頻繁的應(yīng)用在獸醫(yī)診斷中。在檢測(cè)過(guò)程中，常需要對(duì)檢測(cè)樣本進(jìn)行核酸提取純化，需要投入大量的時(shí)間，其復(fù)雜的提取步驟容易造成交叉污染。為能更加快速準(zhǔn)確的進(jìn)行疫病檢測(cè)，免核酸提取產(chǎn)品成為了疫病檢測(cè)的最佳選項(xiàng)。本文通過(guò)對(duì)禽流感病毒培養(yǎng)物、臨床樣本中的病毒核酸進(jìn)行研究，用以評(píng)價(jià)免核酸提取與常規(guī)核酸提取兩者在陽(yáng)性符合率、病毒復(fù)制、檢測(cè)效果等方面的差異，為臨床疫病檢測(cè)監(jiān)控提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本

樣本采集方法：用無(wú)菌棉拭子探入喉頭口及上顎裂來(lái)回刮3～5次取咽喉分泌液，放入加有無(wú)菌1 毫升PBS緩沖液的無(wú)菌1.5 毫升離心管中備用。樣本來(lái)源：全省抽取的5000例家禽的泄殖腔拭子和咽喉拭子、禽流感H5、H7、H9病毒培養(yǎng)樣本各選取1例。

1.2 試劑與方法

1.2.1 常規(guī)熒光定量PCR檢測(cè)法 使用天根生化科技（北京）有限公司的磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒，配套賽默飛KingFisher Flex全自動(dòng)核酸提取儀對(duì)病毒培養(yǎng)物樣本、稀釋的病毒培養(yǎng)物樣本、臨床樣本進(jìn)行核酸提取制備，提取時(shí)間為40～60分鐘。核酸提取完畢后，用QIAGEN的禽流感 H5/H7/H9熒光定量PCR試劑盒，對(duì)病毒培養(yǎng)物核酸、稀釋的病毒培養(yǎng)物核酸、臨床樣本核酸進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR法）檢測(cè)；將上述處理好的核酸樣本加樣上機(jī)，用ABI7500熒光定量P C R儀進(jìn)行擴(kuò)增，收集熒光信號(hào)，進(jìn)行結(jié)果判定。本階段時(shí)間為90分鐘。整個(gè)實(shí)驗(yàn)整體完成時(shí)間為130～150分鐘。

1.2.2 免提取熒光定量P C R檢測(cè)法 使用北京大有泰萊生物技術(shù)有限公司的禽流感H5/H7/H9免提取熒光定量PCR試劑盒，對(duì)病毒培養(yǎng)物核酸、稀釋的病毒培養(yǎng)物核酸、確診的臨床陽(yáng)性樣本核酸進(jìn)行熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)；用試劑盒配套的樣本處理液將樣本進(jìn)行待檢處理，直接加樣上機(jī)，用賽默飛ABI7500熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，收集熒光信號(hào)，進(jìn)行結(jié)果判定。本階段時(shí)間為100分鐘。整個(gè)實(shí)驗(yàn)整體完成時(shí)間為105～110分鐘。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 常規(guī)熒光定量PCR和免提取熒光定量PCR對(duì)病毒培養(yǎng)物檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

對(duì)于H5、H7和H9病毒培養(yǎng)物樣本，根據(jù)100、10-1、10-2、10-3和10-4的稀釋倍數(shù)，分別進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，免提取熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果和傳統(tǒng)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致，符合率100%。檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表1。

結(jié)果表明高病毒濃度的病毒培養(yǎng)物、低病毒濃度的病毒培養(yǎng)物，免核酸提取方法均能滿足準(zhǔn)確檢測(cè)判定的需求。

2.2 常規(guī)熒光定量PCR和免提取熒光定量PCR對(duì)臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果

對(duì)5 0 0 0份臨床樣本，用QIAGEN的常規(guī)熒光熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)，樣本陰陽(yáng)性判定結(jié)果見(jiàn)表2。

確診為陽(yáng)性樣本的，再根據(jù)100、10-1、10-2和10-3的稀釋倍數(shù)，分別進(jìn)行H5、H9病毒檢測(cè)，其陽(yáng)性符合率依然一致。檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表1

結(jié)果表明高病毒濃度的臨床樣本、低病毒濃度的臨床樣本，免提取的熒光定量PCR試劑均能滿足準(zhǔn)確檢測(cè)判定的需求。

應(yīng)用免核酸提取方法對(duì)禽流感病毒H5/H7/H9亞型的病毒培養(yǎng)物、稀釋的病毒培養(yǎng)物、臨床陽(yáng)性樣本、稀釋的臨床弱陽(yáng)性樣本進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)核酸提取熒光定量PCR檢測(cè)方法結(jié)果一致，可以滿足禽流感病毒H5/H7/H9亞型的病毒檢測(cè)需求。綜上所述，免核酸提取熒光定量PCR方法檢測(cè)的陽(yáng)性復(fù)合率100%符合，且可以有效的提高實(shí)驗(yàn)效率，此方法可以有效應(yīng)用于動(dòng)物疫病臨床監(jiān)測(cè)。