陳文玲 王憲東 陳文慧 朱曉松 姚 政 石安華

(1 云南中醫(yī)學院,昆明,650000; 2 云南省中醫(yī)中藥研究院,昆明,650223)

肝纖維化(Hepatic Fibrosis)是指肝臟內彌漫性細胞外基質過度增生堆積的病理階段,是肝臟在多種病因的作用下,肝細胞損傷后自我修復的病理反應。誘發(fā)肝纖維化的病因多種多樣,其中病毒性肝炎為主要病因[1]。肝纖維化早期癥狀不明顯,患者常無明顯表象,如不及時治療,發(fā)展到后期極容易發(fā)展成為肝硬化[2]。慢性肝病現已成為威脅全球的人類身體健康的主要誘因,且在肝硬化失代償期難以治療,病死率極高,所以早期治療及預防肝纖維化的發(fā)生極為關鍵。α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth Muscle Actin,α-SMA)是肝星狀細胞(HSC)活化的標志,活化的HCS胞體展開,突出延長,增殖活躍,胞質內脂滴消失,表達α-SMA,產生ECM的能力增強,表明已轉變?yōu)榧〕衫w維細胞(Myofibroblast,MFB),除了增加基質成分的合成之外,還能調節(jié)ECM的降解,在肝纖維化的進程中起核胞。我們在前期研究中發(fā)現,健脾軟肝方可以有效的治療二甲基亞硝胺誘導的肝纖維化大鼠,健脾軟肝方抑制ColⅠ、ColⅢ膠原的合成,促使其降解,并在抑制HSC活化等方心作用。肝臟中僅有大血管壁平滑肌細胞存在α-SMA表達,其余肝臟細胞內都無α-SMA表達;若肝臟細胞中出現大量α-SMA細胞表達,說明肝星狀細胞已經轉化為肌成纖維細面較優(yōu)[3],但是否與α-SMA蛋白及其mRNA的表達有關還不清除,本實驗以肝纖維化為研究對象,通過檢測肝纖維化大鼠α-SMA蛋白及其mRNA表達的影響,探討健脾軟肝方抗肝纖維化的機制是否與肝纖維化形成和發(fā)展有關。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 本實驗選用健康雄性大鼠60只,體重(150±10) g,由四川達碩生物科技有限公司提供,動物質量合格證書編號:0017752。所有大鼠自由飲水、攝食，云南中醫(yī)學院實驗動物房中分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～22 ℃，相對濕度50%～55%，通風良好。

1.1.2 藥物 健脾軟肝方由蘭花參、白芍、莪術、香附、三七等中藥組成,生藥購自云南中醫(yī)學院校醫(yī)院門診部藥方,扶正化瘀膠囊購自于云南省中醫(yī)醫(yī)院門診部藥方,生產廠家為上海黃海制藥有限責任公司,生產批號:140309。

1.1.3 試劑與儀器 1)主要試劑：鼠抗α-SMA單克隆抗體，由博士德生物有限公司提供，大鼠α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)ELISA檢測試劑盒及DAB免疫組化顯色試劑盒由生工生物工程(上海)有限公司提供。2)主要儀器：DGX-9140電熱恒溫干燥箱(太倉市華利達實驗設備有限公司)，熒光顯微鏡、Image-pro Plus5.0圖像分析系統(tǒng)(日本Olympus株式會社)，SW-CJ-1D潔凈工作臺(江蘇蘇潔凈化設備廠)，HC-2518R高速冷凍離心機(安徽中科中佳儀器有限公司)，TU-1901紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)，PCR反應擴增儀、移液器(加拿大BIO公司)，StepOne型熒光定量PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)中國公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物的分組與模型制備 實驗所用動物隨機分為6組,即正常組,模型組,扶正化瘀膠囊組,健脾軟肝方低劑量組,健脾軟肝方中劑量組,健脾軟肝方高劑量組,10只/組。肝纖維化動物模型的建立成功與否,是研究肝纖維化發(fā)生發(fā)展的前提。本實驗從第1周起,2次/周對大鼠進行腹腔注射,共注射四周,劑量為0.2 mL/100 g。其中模型組、扶正化瘀膠囊組、健脾軟肝方低劑量組、健脾軟肝方中劑量組、健脾軟肝方高劑量組分別腹腔注射70%橄欖油與30% CCl4混合溶液,正常組腹腔注射等量的生理鹽水。各組大鼠均給予普通飼料飼養(yǎng),自由飲水。

1.2.2 動物給藥劑量及方法 健脾軟肝方按等效劑量換算法,成人每日用量為60 g,每200 g大鼠1 d所需生藥量(g)=60 g×0.018=1.08,為0.54 g/100 g·d。扶正化瘀膠囊組規(guī)格為0.3 g/粒,成人每日每次用量為:3次/d,5粒/次。據人和大鼠間體表面及折算的等效劑量比值表計算臨床等效劑量,從第一周開始給予空白組和模型組等量的生理鹽水灌胃,健脾軟肝方高、中、低劑量組每天給予相應劑量灌胃(分別是1.08 g/100 g·d、0.54 g/100 g·d、0.27 g/100 g·d),扶正化瘀膠囊組給予灌胃0.0405 g/100 g·d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 病理組織學檢查 病理組織學采用H-E及Mallory染色2種染色方法,染色后通過光學顯微鏡觀察并記錄切片中大鼠肝組織的病變程度。在第4周末,各組大鼠禁食12 h,飲水正常。第2天以10%的水合氯醛配90%生理鹽水,按照每0.25 mL/100 g的劑量計算,對大鼠腹腔注射麻醉,迅速取出大鼠肝臟,分切成1 cm×1 cm×3 cm,置于福爾馬林溶液保存?zhèn)溆?并分別進行脫水、包埋、脫蠟、染色、封片,進行H-E及Mallory染色觀察。

1.2.3.2 肝纖維化分級 肝纖維化的分級標準是根據觀察匯管區(qū)周圍肝細胞炎性反應程度、小葉內情況及纖維增生程度,將肝纖維化分為4級,具體分級標準參考中華醫(yī)學會2002年肝病學肝纖維化診斷及療效評估共識[4]。見表1。

表1 肝纖維化分級

1.2.3.3 免疫組化ABC法檢測大鼠肝組織中α-SMA的蛋白表達 將標本放置于4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定,取材后放置于20%蔗糖溶液12 h,制作蠟塊,制作切片,并貼片,PBS清洗。之后將切片分別放置于0.3%的過氧化氫甲醇溶液30 min、0.3% Triton X100 30 min、血清稀釋液稀釋的一抗在4 ℃冰箱中放置24～48 h、于PBS稀釋的的二抗中室溫孵育2 h、ABC復合物之類的抗體室溫孵育2 h,最后將切片放置于顯色液中,進行染色,時間控制在30 min左右,在這期間需要經常在顯微鏡下進行觀察,若細胞著色且背底顏色較淡時,應迅速清除顯色液,α-SMA蛋白陽性表達在切片上呈棕黃色,利用Image-pro Plus 6.0軟件分對切片進行定量分析,每張切片在光學顯微鏡下去5個視野(×40),測定α-SMA蛋白陽性表達的灰度值與總視野面積比值。

1.2.3.4 采用Real-time PCR法檢測cDNA樣本中α-SMA基因相對含量 大鼠肝組織α-SMA的表達采用Real-time PCR法。將大鼠肝臟組織均質化、勻漿并離心,提取上清液,之后相分離上清液,抽取肝組織水相中的總RNA,按試劑盒說明操作,然后以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列:α-SMA上游引物5′-CGGGAGAAAATGACCCAGAT-3′，下游引物5′-CCAGAGTCCAGCACAATACCA-3′；內參β-actin上游引物5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物5′-AGCCACCAATCCACACAGAG-3′；在PCR管中加入total RNA,Random Primer p(dN)6,之后冰浴,離心加入下列試劑,37 ℃溫浴5 min、42 ℃溫浴60 min、70 ℃溫浴10 min。終止反應,最后將上述溶液-20 ℃保存。完成上述步驟后，把加好樣品的96孔板放在ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀中進行反應。收集數據,采用2-△△Ct法,通過Ct值對樣本基因表達量的進行計算。

2 結果

2.1 大鼠大體形態(tài)和大鼠肝臟觀察 實驗從第一周便開始造模,正常組大鼠飲食飲水正常,毛色光澤,大小便正常,身體狀態(tài)良好。模型組大鼠進食及進水量均減少,毛色暗黃無光澤,大便時而稀溏不成形,小便色黃,精神萎靡,注射部位無紅腫感染,肛門區(qū)紅腫。健脾軟肝方高、中、低劑量組大鼠與模型組比較活動度較好,進食進水量較模型組比較有所增加,毛色較光澤,大便時而有稀溏但總體狀況較好,腹腔注射部位無感染。正常組大鼠肝臟呈褐色,體積適中,表面光滑,質地柔軟,邊緣呈銳圓狀,無結締組織粘連,無包塊。模型組大鼠肝臟較正常組顏色淺,呈暗紅色,肝臟體積大于正常組,表面有結節(jié),質地較硬,邊緣呈鈍圓莊且有結締組織粘連。扶正化瘀膠囊組及健脾軟肝方高、中、低劑量組大鼠肝臟顏色較模型組色澤變深,表面較光滑,肝臟大小與正常組比較稍微增大,表面有輕微結節(jié),質地硬,但總體狀況好于模型組。

圖1 正常組

圖2 模型組

圖3 扶正化瘀膠囊組

圖4 健脾軟肝方高劑量組

圖5 健脾軟肝方中劑量組

圖6 健脾軟肝方低劑量組

2.2 大鼠肝臟病理組織學觀察 H-E染色,光學顯微鏡下提示,正常組大鼠肝小葉結構正常,肝細胞呈現卵圓狀,并以中央靜脈為圓心,肝細胞呈放射狀排列,細胞核呈圓形,肝索排列規(guī)則。模型組大鼠肝細胞腫脹變形,假小葉形成,肝索排列紊亂,局部肝細胞發(fā)生脂肪變性,膠原纖維組織擴大。此種現象說明CCl4誘導的肝纖維化大鼠造模已經成功。健脾軟肝方高、中、低劑量組及扶正化瘀膠囊組病變程度與模型組比較,病變程度較輕,肝索排列紊亂,有假小葉形成,脂肪病變程度較輕,有少許脂肪樣空泡形成,且膠原纖維減少,但光鏡下并不能明顯判斷各組間差別。

圖7 正常組×100

圖8 模型組×100

圖9 扶正化瘀膠囊組×100

圖10 健脾軟肝方高劑量組×100

Mallory染色時,切片上膠原纖維會表現為藍色絲帶狀組織。光學顯微鏡下,正常組大鼠肝小葉結構正常,肝細胞呈卵圓狀,肝細胞呈放射狀排列,細胞核圓形,肝索排列規(guī)則。模型組大鼠肝細胞變性,假小葉形成,大量脂肪空泡出現,纖維結締組織大量沉積,肝小葉和匯管區(qū)機構被破壞。健脾軟肝方高、中、低劑量組及扶正化瘀膠囊組有假小葉形成,各組匯管區(qū)有少量纖維結締組織沉積,并少量脂肪空泡聚集,肝小葉的結構有一定程度的破壞,但總體破壞程度較與模型組比較好。

圖11 健脾軟肝方中劑量組×100

圖12 健脾軟肝方低劑量組×100

圖13 正常組×40

圖14 模型組×40

2.3 肝纖維化的分級程度 Mallory染色完成后,觀察切片后發(fā)現,模型組大鼠肝組織中,假小葉形成較多,大部分處于S3型這一階段這也從側面提示動物模型復制成功。健脾軟肝方高、中、低劑量組及扶正化瘀膠囊組大鼠肝組織中有少量膠原纖維形成,但大部分處于S2階段,說明治療后有一定效果,各組大鼠肝纖維化程度有所減輕。

圖15 扶正化瘀膠囊組×40

圖16 健脾軟肝方高劑量組×40

圖17 健脾軟肝方中劑量組×40

圖18 健脾軟肝方低劑量組×40

表2 肝纖維化的分級程度(只,n=10)

注:與模型組比較*P<0.05;與正常組比較,△P<0.05

2.4 各組大鼠肝組織α-SMA蛋白的表達的觀察 肝組織α-SMA蛋白的表達,正常組大鼠肝組織中僅在血管壁周圍見少量α-SMA表達,模型組大鼠肝組織中見大量α-SMA表達,主要集中在匯管區(qū)、中央靜脈、假小葉纖維膈及臨近的肝竇區(qū)周圍。正常組與模型組比較,模型組顯著上升(P<0.05);扶正化瘀膠囊組與模型組比較有顯著性差異(P<0.05);健脾軟肝方高、中、低劑量組組與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),健脾軟肝方高、中、低劑量組之間α-SMA蛋白在肝組織中陽性表達逐漸升高,可以呈一定的藥物依賴關系。

注:與模型組比較*P<0.05;與正常組比較,△P<0.05

圖19 正常組(×400)

圖20 模型組(×400)

圖21 扶正化瘀膠囊組(×400)

圖22 健脾軟肝方高劑量組(×400)

圖23 健脾軟肝方中劑量組(×400)

圖24 健脾軟肝方低劑量組(×400)

2.5 各組大鼠肝組織α-SMA mRNA的表達 肝組織α-SMA mRNA的表達:正常組與模型組比較,模型組顯著上升(P<0.05);扶正化瘀膠囊組為與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);健脾軟肝方高、中、低劑量組組與模型組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),高、中、低劑量組之間α-SMA mRNA表達水平逐漸升高,呈一定的藥物依賴關系。

表4 各組大鼠肝組織α-SMA mRNA的表達

注：與模型組比較*P<0.05;與正常組比較,△P<0.05

3 討論

肝纖維化是一種慢性肝損傷導致的肝臟病理改變,HSC的活化是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)[5]。HSC在肝臟中稱之為儲脂細胞,屬于肝臟間質細胞,正常情況下HSC呈卵圓狀,位于肝索與肝竇壁之間,可以貯藏脂肪與維生素A,合成少量金屬蛋白酶抑制劑等,當各種致病因素持續(xù)作用于肝臟時,通過復雜的機制激活HSC。HSC被激活后,轉化為肌成纖維細胞,然后其在肝臟內合成膠原纖維、蛋白多糖及糖蛋白等,從而形成了ECM并大量堆積于肝臟中,最終導致肝纖維化的發(fā)生[6]。平滑肌肌動蛋白共分為γ亞型、α、β 3型,其中α-SMA所占比例最高,α-SMA存在于脊椎類動物細胞中,其在細胞內有豐富的能聚合成微絲,微絲可以撐起細胞的骨架,加強細胞的能動性,并可以促進細胞的收縮及形成[7]。在生理條件下,α-SMA主要由平滑肌細胞和肌成纖維細胞表達,其表達很少,僅存在于血管壁上。當HSC被激活后,α-SMA表達大量增加,并附著于假小葉增生的纖維膈內。在各種急慢性肝病及相應的動物模型中,大鼠HSC在活化過程中喪失Desmin,轉而表達α-SMA[8]。α-SMA是HSC活化的特有標志物,α-SMA的表達與HSC的活化、增殖、復制呈正相關[9]。劉成[10]教授觀察肝纖維化形成過程中α-SMA與門脈壓力變化之間的關系,研究發(fā)現隨著肝纖維化程度的加重,α-SMA的表達也逐漸增加,二者呈正相關,且隨著α-SMA病變面積的擴大,門脈壓力也隨之增加,二者也呈正相關。

α-SMA作為肝細胞內肌動蛋白之一,對肝纖維化的發(fā)生發(fā)展起重要作用,是肝星狀細胞活化的重要標志。謝君等[11]觀察肝蘇顆粒對CCl4致肝纖維化大鼠肝功能和病理損傷的影響,免疫組化結果發(fā)現肝蘇顆?？梢越档挺?SMA蛋白的表達,改善肝功能,減輕肝纖維化的病變程度。邵佳亮等[12]觀察羥基喜樹堿對CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型具有防治作用,結果發(fā)現羥基喜樹堿可以抑制肝星狀細胞的增殖,減少α-SMA蛋白的表達。本次實驗,我們采用免疫組化ABC法檢測大鼠肝組織中α-SMA蛋白的表達,通過結果,我們觀察發(fā)現,正常組大鼠肝組織中僅在血管壁周圍見少量α-SMA蛋白表達,模型組大鼠肝組織中見大量α-SMA蛋白表達,主要集中在匯管區(qū)、中央靜脈及臨近的肝竇區(qū)周圍。扶正化瘀膠囊組,健脾軟肝方高、中、低劑量組在匯管區(qū)也可見α-SMA蛋白的表達,但其病變程度比較模型組有所減輕,說明健脾軟肝方可以減少α-SMA蛋白的表達。馬力等[13]觀察瘧母丸對進展期大鼠肝纖維化的干預作用,研究發(fā)現瘧母丸可以顯著的降低α-SMA mRNA的表達,抑制肝纖維化的進展,且這一機制與抑制HSC的活化有關。吳芙蓉等[14]觀察橙皮苷對化學性肝纖維化大鼠α-SMA表達的影響,實驗結果發(fā)現橙皮苷可以顯著的降低大鼠肝組織中α-SMA及其mRNA的表達,提示橙皮苷對化學性肝纖維化大鼠具有很好的保護作用,其機制與抑制肝星狀細胞的增殖、活化有關。本次實驗,我們采用Real-time PCR法檢測大鼠肝組織中α-SMA mRNA的表達,通過結果,我們觀察發(fā)現,正常組大鼠肝組織中僅少量表達α-SMA mRNA,正常組與模型組比較,模型組大鼠肝組織中α-SMA mRNA表達顯著上升(P<0.05);扶正化瘀膠囊組與模型組比較,肝組織中α-SMA mRNA表達顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);健脾軟肝方高、中、低劑量組肝組織中α-SMA mRNA表達也顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),高、中、低劑量組之間α-SMA mRNA表達水平逐漸升高,呈一定的藥物依賴關系。由此可見,我們的結果與眾多專家的研究結論相一致,說明健脾軟肝方可以減少α-SMA mRNA的表達,其機制可能與抑制HSC的活化有關,從而起到治療肝纖維化的作用。此外,大鼠肝臟病理組織學Mallory染色結果也顯示,健脾軟肝方高、中、低劑量組及扶正化瘀膠囊組大鼠肝組織匯管區(qū)有少量纖維結締組織沉積,并少量脂肪空泡聚集,肝小葉的結構有一定程度的破壞,但總體破壞程度較模型組比較好,這進一步說明了健脾軟肝方可以改善大鼠肝纖維化的病變程度。