阿依努爾·亞森

摘要：在對(duì)綿羊白細(xì)胞中的慢病毒Cdna gag基因進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，通過(guò)PCG檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用還能夠起到良好的檢測(cè)效果，對(duì)于該病毒的防治以及促進(jìn)我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展也有著一定的積極意義。

關(guān)鍵詞：綿羊白細(xì)胞;慢病毒;PCR

中圖分類號(hào)：S585.26

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.2018.10.003

0 引言

綿羊慢病毒會(huì)直接侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致腦膜腦炎等疾病的發(fā)生，并有著消瘦、呼吸困難以及淋巴濾泡性間質(zhì)性肺炎等臨床癥狀。其不同株盡管存在有一定的變異性，但是依舊存在有較高的同源性。通過(guò)PCR技術(shù)的應(yīng)用能夠?qū)d羊外周血白細(xì)胞基因組中的OPP前病毒cDNAgag基因片段進(jìn)行擴(kuò)增整合，借此來(lái)獲得良好的OPPV檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與血液樣品

本次研究中主要選用了3株新疆拉庫(kù)爾羊陽(yáng)性血液以及2株新疆拉庫(kù)爾羊陰性血液作為血液樣品。

1.1.2 試劑

主要試劑包含有OPPV抗原以及標(biāo)準(zhǔn)OPPV陽(yáng)性對(duì)照血清等。此外還需要應(yīng)用到Shol限制性內(nèi)切酶、Tap DNA聚合酶等。

1.2 方法

1.2.1 血清學(xué)實(shí)驗(yàn)

對(duì)200g凝血塊離心10 min來(lái)進(jìn)行血清的分離，在-20℃低溫下進(jìn)行存儲(chǔ)，對(duì)5株新疆拉庫(kù)爾羊的OPPV抗體進(jìn)行血清檢測(cè)。

1.2.2 DNA制備

在目標(biāo)樣品靜脈抽取10 mL血，加入10 U/mL的肝素以及20 mL的淋巴細(xì)胞分離液之后，利用5000 r離心速度處理5 min。移除樣品中的紅細(xì)胞跟上清液，然后加入SDS使其濃度達(dá)到0.5%，在此基礎(chǔ)上放入蛋白酶K進(jìn)行10 h的孵育處理，期間震蕩處理2～3次。處理完成之后加入等體積的酚進(jìn)行混勻處理，然后在12000 r下離心處理10 min，通過(guò)70%乙醇洗滌1～2次，在室溫條件下晾干。進(jìn)行沉淀處理得到RNA酶，在4℃下進(jìn)行懸浮沉淀處理5h，將制備完成后的DNA酶樣品放置在-20℃低溫下進(jìn)行保存?zhèn)溆肹l]。

1.2.3 進(jìn)行白細(xì)胞疑似整合基因組的酶切

通過(guò)DNAman軟件來(lái)對(duì)OPPV基因組進(jìn)行分析處理，通過(guò)Xhol以及Ndel限制內(nèi)切酶進(jìn)行基因組的酶切處理，在結(jié)合了基因組酶切結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)行引物的合理設(shè)置。

1.2.4

PCR產(chǎn)物的克隆

運(yùn)用CaCl'完成DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的制備處理工作，在pBS-T載體連接擴(kuò)增片段回收產(chǎn)物，并進(jìn)行DH5 α感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化處理。然后在100 mg/mL Apm的LB固體培養(yǎng)基上對(duì)培養(yǎng)后的克隆菌株進(jìn)行篩選處理。

1.2.5 鑒定

首先選取3μL擴(kuò)增產(chǎn)物，將其放置在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳跟擴(kuò)增處理。在對(duì)質(zhì)粒酶切進(jìn)行鑒定時(shí)，先將篩選后的陽(yáng)性菌培養(yǎng)一夜，然后通過(guò)離心株型質(zhì)粒小提試劑對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行提取。通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察并照相。

2 結(jié)果

在經(jīng)過(guò)診斷檢測(cè)之后，GAG基因PCR、菌落PCR以及重組子酶切鑒定結(jié)果分別見(jiàn)圖1、圖2、圖3。

3 討論

OPPV是反轉(zhuǎn)錄病毒基因組的轉(zhuǎn)錄，特點(diǎn)為DNA中間型，因此病毒RNA也就能夠通過(guò)pol基因編碼中的反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄為前病毒cDNA，前病毒DNA也可以直接整合在宿主的白細(xì)胞熱色提上面，并能夠在RNA多聚酶的催化作用下直接轉(zhuǎn)錄為正鏈RNA，也就是由整合在白細(xì)胞內(nèi)的前病毒產(chǎn)生新的病毒粒子。在這一病毒表現(xiàn)模式之中，能夠讓病毒處于隱蔽的循環(huán)狀態(tài)中，從而躲過(guò)機(jī)體的防御系統(tǒng)。但是在該病毒表現(xiàn)機(jī)制中還給予病毒的研究工作帶來(lái)了一定的便利性，研究者們不需要再進(jìn)行病毒RNA的體外反轉(zhuǎn)錄工作，僅僅憑借PCR檢測(cè)法就能夠?qū)PPV中前病毒cDNA起到良好的檢測(cè)效果，從而驗(yàn)證病毒的存在。Gag基因作為OPPV病毒中比較保守的基因序列.慢病毒中不同株間的gag基因核苷酸序列還保持有非常高的相似性，通過(guò)Genbank中所提供的慢病毒基因序列合成物，還能夠?qū)PPV整合在內(nèi)的白細(xì)胞中的cDNA起到良好的PCR鑒定效果，從而就該病毒的感染機(jī)制進(jìn)行有效的研究。在傳統(tǒng)的AGID檢測(cè)以及ELISA檢測(cè)模式中，只能夠?qū)Σ糠指腥玖薕PP綿羊的抗體進(jìn)行檢測(cè)，但是部分病羊因?yàn)樽陨頇C(jī)體因素的影響，還存在某些時(shí)期不產(chǎn)生抗體或者產(chǎn)生的抗體過(guò)弱等問(wèn)題的出現(xiàn)，在這些傳統(tǒng)的檢測(cè)模式中也就容易導(dǎo)致假陰性反應(yīng)的發(fā)生，給羊群的凈化跟治療也就帶來(lái)的諸多的不便。通過(guò)PCR檢測(cè)法來(lái)進(jìn)行前病毒cDNA的檢測(cè)過(guò)程中，其能夠使得OPPV的檢測(cè)流程變得更加的簡(jiǎn)單跟快捷，并能夠?qū)崿F(xiàn)OPP的早期準(zhǔn)確檢出[2]。

在綿羊自然感染OvLV時(shí)，病毒的復(fù)制數(shù)量跟所能夠誘導(dǎo)的細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)聯(lián)系，因此說(shuō)個(gè)體素質(zhì)的基因型還會(huì)對(duì)綿羊的病變情況起到直接的影響，這也就使得病程在不同階段或者不同的綿羊個(gè)體數(shù)量在整合過(guò)程中，其整合的程度跟難度也存在有非常大的差異性。為了進(jìn)行模板量的合理獲取，要求研究人員在進(jìn)行PCR檢測(cè)之前，通過(guò)DNAman計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行核實(shí)的限制內(nèi)切酶計(jì)算，然后在不影響研究前提下切開(kāi)整個(gè)基因組。此外血液量對(duì)于研究結(jié)果也會(huì)造成比較明顯的影響，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中還需要采取10 mL的血液量作為研究，并將3 mL的血液量作為對(duì)照。研究結(jié)果表明3 mL的血液量無(wú)法通過(guò)PCR擴(kuò)增出特異的條帶，因此說(shuō)明在PCR檢測(cè)過(guò)程中血液多少也是一項(xiàng)限制條素，通過(guò)10 mL血樣進(jìn)行研究時(shí)還能夠促使研究結(jié)果的準(zhǔn)確性得到大幅度的提升。在該研究中所采用的3只陽(yáng)性羊中都是在發(fā)生了病毒血癥的情況下進(jìn)行采血的，這種采血模式還能夠促使慢病毒前DNA的整合數(shù)量得到大幅度的提升，有利于該實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行[3]。

在具體的操作過(guò)程之中，本次研究采用了降落PCR法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)操作，這樣一方面能夠提高產(chǎn)物的產(chǎn)量，另一方面還能夠促使PCR特異性得到大幅度的提升，從而使得目的基因得到準(zhǔn)確的檢測(cè)。此外在本次研究中還采用了38個(gè)循環(huán)數(shù)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，目的在于提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。在相同條件下采用30個(gè)循環(huán)作為對(duì)照組，研究結(jié)果表明30個(gè)循環(huán)跟38個(gè)循環(huán)之間還存在有比較大的差異性，跟模板量低也有著直接的關(guān)系。當(dāng)模板量比較低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致PCR的初期產(chǎn)物量無(wú)法呈現(xiàn)出系數(shù)增長(zhǎng)的情況，只能夠線性增加，而到了PCR后期之后才會(huì)呈現(xiàn)出系數(shù)增加的情況。

近年來(lái)我國(guó)的綿羊養(yǎng)殖行業(yè)得到了迅速的發(fā)展，對(duì)于我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的增長(zhǎng)也起到了良好的促進(jìn)作用。但是在綿羊養(yǎng)殖過(guò)程中還容易受到病毒的影響，也就容易導(dǎo)致一系列疫病的發(fā)生，從而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這也就要求各研究人員能夠加強(qiáng)對(duì)綿羊白細(xì)胞內(nèi)慢病毒cDNA gag基因的檢測(cè)工作，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行病毒防治模式的合理選擇。該研究中發(fā)現(xiàn)通過(guò)PCR檢測(cè)技術(shù)能夠?qū)d羊白細(xì)胞內(nèi)的慢病毒cDNA gag基因起到良好的檢測(cè)效果，對(duì)于促進(jìn)我國(guó)綿羊養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展也有著一定的積極意義。因此各研究人員需要加強(qiáng)對(duì)該方面的研究力度，對(duì)現(xiàn)有的綿羊疫病防治措施進(jìn)行不斷的優(yōu)化完善，幫助養(yǎng)殖人員獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益。

參考文獻(xiàn)

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