響應(yīng)面法優(yōu)化紫薯中花色苷的提取工藝

錢鐳，任德財(cái)，姜濤，辛雪，胡淑敏，劉婷*

(1.黑龍江東方學(xué)院 食品與環(huán)境工程學(xué)部，哈爾濱 150066；2.黑龍江龍丹乳業(yè)科技有限公司，哈爾濱 150086)

紫薯，又叫黑薯，薯肉呈紫色至深紫色。紫薯生長(zhǎng)在較溫暖的地方，莖葉適宜生長(zhǎng)溫度為18～25 ℃，溫度低于15 ℃時(shí)停止生長(zhǎng)[1，2]。根最適生長(zhǎng)的地溫為22～24 ℃，地溫低于20 ℃時(shí)紫薯停止膨大。紫薯主要分布在廣西、廣東、湖北、湖南、江西、福建、亞洲的其他熱帶地區(qū)。野生紫薯的塊莖多為棒狀或圓柱形，表面黑色或棕色，斷面紫色、白色或黃色。紫薯可去皮切片烘干，將其粉碎后加工成紫薯粉，色澤美觀，營(yíng)養(yǎng)成分豐富，可以作為食品加工的原料，還可作為各種糕點(diǎn)類的主料或配料。同時(shí)紫薯將成為花色素的主要原料之一。

天然食用色素的來源廣泛，種類豐富而且大多數(shù)對(duì)人體無毒害作用，它們除具有特殊的色、香、味外，還具有保健和營(yíng)養(yǎng)作用，用作食品添加劑既能使產(chǎn)品更貼近食品本身的色澤，又可增加食品的風(fēng)味特性[3]。在自然界中，花青素是植物中主要的呈色物質(zhì)之一，是一類水溶性的天然色素，屬多酚類類黃酮化合物，又名花色素[4]。它普遍存在于植物的莖、花、果肉及葉的液泡里，是自然植物的次生代謝產(chǎn)物，由于pH 對(duì)其色澤的影響較大，在酸性環(huán)境中呈現(xiàn)紅色，在堿性環(huán)境中則顯現(xiàn)藍(lán)色，因此能賦予植物特殊的顏色[5]。花色苷對(duì)致癌物質(zhì)有抑制作用，還具有抑制肥胖，增強(qiáng)人體免疫力，增強(qiáng)體質(zhì)，延緩衰老，提升視力等多種作用[6-8]。

試驗(yàn)使用有機(jī)溶劑法來提取紫薯的花色苷[9]，在預(yù)處理期間采用水蒸氣加熱方式處理紫薯。進(jìn)行適當(dāng)時(shí)間的蒸煮處理，使富含在紫薯中的糖苷發(fā)生水解，使花青素以不同程度進(jìn)行釋放，進(jìn)而產(chǎn)生糖苷化作用生成花色苷[10]。加熱狀態(tài)下，紫薯花色苷形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，先從結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，細(xì)胞壁被破壞后，細(xì)胞液中滲出花色苷，使花色苷的含量有所增加[11]。使用真空冷凍干燥方法能更好地保留紫薯原有的營(yíng)養(yǎng)成分與色澤，以保護(hù)容易氧化的物質(zhì)。本文還研究了提取溫度、料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間對(duì)紫薯花色苷提取的影響，并采用響應(yīng)面優(yōu)化分析的方法，得到了提取工藝的最佳參數(shù)，為天然色素的提取工藝及應(yīng)用提供理論參考[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯：由江蘇省興化市味野食品有限公司提供；醋酸鈉、無水乙醇、鹽酸、氯化鉀：均為分析純，選自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FW100高速萬能粉碎機(jī) 上海書培實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FDU-1100冷凍干燥機(jī) 東京理化器械株式會(huì)社；SH11YX/UV-8000S紫外-可見分光光度計(jì) 上海陵光技術(shù)有限公司；LD5-2B低速高效離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；JJ200電子分析天平 常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，HWS-26電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紫薯預(yù)處理

將紫薯洗凈，放在室溫下使其表皮水分完全蒸發(fā)，用刀切成厚度為1 cm的薄片，將其放入蒸氣蒸煮，溫度為100 ℃，時(shí)間為20 min(蒸熟)，然后用刀切成厚度為0.5 cm的薄片，將其放在冷凍干燥機(jī)中，于-20 ℃下預(yù)凍24 h之后，再進(jìn)行真空冷凍干燥，使凍干后的紫薯薄片粉粹過篩(80目)得到紫薯粉。

1.3.2 紫薯花色苷提取

按照一定料液比，將紫薯在80%乙醇和60 ℃的條件下提取1 h后，提取液離心(5000 r/min)5 min后，過濾得到花色苷的上清液，反復(fù)提取2次，合并上清液放于瓶中待用。

1.3.3 紫薯花色苷含量測(cè)定

采用pH示差法來測(cè)定紫薯花色苷含量。由試驗(yàn)可知紫薯花色苷的最大吸收波長(zhǎng)為535 nm。吸取待測(cè)液2.0 mL，分別用pH 1.0 和pH 4.5的緩沖溶液稀釋至一定體積。分別在535 nm處和700 nm處測(cè)定提取溶液的吸光度(A)，以干質(zhì)量計(jì)算，計(jì)算公式如下：

花色苷含量(mg/g)=A/(ε×L)×MW×DF×V/m。

式中：A=(A535pH 1.0-A700pH 1.0)-(A535pH 4.5- A700pH 4.5)；V為溶液定容的體積：mL；DF為溶液的稀釋倍數(shù)；MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26900 L/(mol·cm)；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449.2 g/mol； L為比色皿的寬度，1 cm；m為樣品紫薯質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

1.3.4.1 研究提取時(shí)間對(duì)紫薯花色苷含量的影響

稱取紫薯粉末2.000 g，以60%乙醇為溶劑，按料液比1∶20，在60 ℃下分別提取30，60，90，120，150 min進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.4.2 研究料液比對(duì)紫薯花色苷含量的影響

稱取紫薯粉末2.000 g，以60%乙醇為溶劑，分別以料液比1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，在60 ℃下提取90 min進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.4.3 研究提取溫度對(duì)紫薯花色苷含量的影響

稱取紫薯粉末2.000 g，以60%乙醇為溶劑，按料液比1∶20，分別在提取溫度為30，40，50，60，70 ℃下提取90 min進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.4.4 研究乙醇濃度對(duì)紫薯花色苷含量的影響

稱取紫薯粉末2.000 g，分別以濃度為50%，60%，70%，80%，90%的乙醇為溶劑，料液比 1∶20，在60 ℃下提取90 min進(jìn)行試驗(yàn)[13]。

1.3.5 用響應(yīng)面法優(yōu)化提取花色苷工藝

以提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比為自變量，以提取液中的花色苷含量為響應(yīng)值，采用中心組合設(shè)計(jì)3水平4因素的響應(yīng)面試驗(yàn)，其試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平表Table 1 Experimental factors and levels table

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響

圖1 提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響Fig.1 Effect of extraction time on the content of anthocyanins in the extract

由圖1可知，花色苷隨著提取時(shí)間的增加，在溶劑中一點(diǎn)點(diǎn)地溶出，在90 min時(shí)，花色苷含量逐漸達(dá)到最大值。長(zhǎng)時(shí)間的提取會(huì)導(dǎo)致花色苷的降解，與此同時(shí)溶劑也會(huì)揮發(fā)一部分，使一部分花色苷損失。因此，選擇提取時(shí)間90 min作為紫薯花色苷的最佳提取條件。

2.1.2 料液比對(duì)花色苷含量的影響

圖2 料液比對(duì)花色苷含量的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the content of anthocyanins in the extract

由圖2可知，紫薯花色苷含量在料液比增加的條件下，趨勢(shì)為先增大后減小。當(dāng)料液比過低時(shí)，等同于稀釋了溶劑，這樣不能充分把花色苷提取出來。料液比逐漸增加，使花色苷溶解于溶劑中，由于料液比過高的情況下，也會(huì)導(dǎo)致紫薯粉不能與溶劑充分接觸，這對(duì)于花色苷全部溶出產(chǎn)生阻礙作用。因此，選擇料液比1∶20作為紫薯花色苷的最佳提取條件。

2.1.3 提取溫度對(duì)花色苷含量的影響

圖3 提取溫度對(duì)花色苷含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the content of anthocyanins in the extract

由圖3可知，花色苷含量在提取溫度為60 ℃時(shí)達(dá)到最高。在30～50 ℃之間時(shí)，紫薯粉在溶劑中的溶解能力和溶劑中的擴(kuò)散速度隨著提取溫度的升高而增加，使花色苷含量逐漸上升[14]。溫度在60～70 ℃之間，花色苷出現(xiàn)降解的現(xiàn)象，溫度升高也會(huì)導(dǎo)致乙醇含量的揮發(fā)，使其溶出量減少，花色苷總體含量降低。

2.1.4 乙醇濃度對(duì)花色苷含量的影響

圖4 乙醇濃度對(duì)花色苷含量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the content of anthocyanins in the extract

由圖4可知，花色苷含量在乙醇濃度為60%時(shí)達(dá)到最大值。不同乙醇濃度對(duì)花色苷含量的提取有顯著影響，當(dāng)乙醇濃度較低時(shí)，花色苷含量會(huì)隨乙醇濃度的升高而增加，而當(dāng)乙醇濃度大于60%時(shí)，紫薯花色苷的提取率反而隨著乙醇濃度的升高而降低。因此，選擇乙醇濃度為60%作為紫薯花色苷的最佳提取條件。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化紫薯花色苷提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)為4因素3水平，其試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

應(yīng)用 Design Expert 8.0.6 軟件，以乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度為響應(yīng)變量，以花色苷含量為響應(yīng)值，對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，得到的預(yù)測(cè)模型如下：

Y=1.20-0.017A-0.0089B+0.028C+0.021D+0.0089AB-0.015AC+0.032AD+0.038BC-0.022BD-0.003CD-0.10A2-0.033B2-0.082C2-0.041D2。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

注：R2=0.9105,RAdj2=0.8923,C.V.(%)=3.88,“**”表示極顯著(p<0.01)，“*”表示顯著(0.01

由表3可知，此試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械腜值<0.01，響應(yīng)面回歸模型表示達(dá)到顯著水平，其失擬項(xiàng)值為0.9793(p>0.05)，不顯著；相關(guān)系數(shù)R2=0.9105，RAdj2=0.8923，說明該模型與實(shí)際試驗(yàn)有良好的擬合性，此模型可行。根據(jù)F值可知，回歸模型中各因素對(duì)總花色苷含量的影響大小順序?yàn)镃>D>B>A，即：料液比>提取時(shí)間>提取溫度>乙醇濃度。模型中A2，C2對(duì)花色苷含量的影響極顯著(p<0.01)；A，C，D，D2的影響顯著(p<0.05)；此模型的C.V.為3.88，說明該模型可以較好地反映響應(yīng)值的變化。

2.2.2 因素交互作用對(duì)花色苷含量的影響

通過Design Expert 8.0.6軟件得到各因素間的等高線圖和響應(yīng)曲面, 進(jìn)一步考察各因素之間的交互作用。等高線的形狀為圓形，表示交互作用不顯著；若其形狀為橢圓，表示交互作用顯著。

2.2.2.1 提取溫度和乙醇濃度的交互作用

提取溫度和乙醇濃度對(duì)花色苷含量的影響見圖5。

圖5 提取溫度和乙醇濃度對(duì)花色苷含量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature and ethanol concentration on the content of anthocyanins in the extract

2.2.2.2 料液比和乙醇濃度的交互作用

乙醇濃度和料液比對(duì)花色苷含量的影響見圖6。

圖6 乙醇濃度和料液比對(duì)花色苷含量的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration and solid-liquid ratio on the content of anthocyanins in the extract

2.2.2.3 提取時(shí)間和乙醇濃度的交互作用

提取時(shí)間和乙醇濃度對(duì)花色苷含量的影響見圖7。

圖7 提取時(shí)間和乙醇濃度對(duì)花色苷含量的影響Fig.7 Effect of extraction time and ethanol concentration on the content of anthocyanins in the extract

2.2.2.4 料液比和提取溫度的交互作用

料液比和提取溫度對(duì)花色苷含量的影響見圖8。

圖8 料液比和提取溫度對(duì)花色苷含量的影響Fig.8 Effect of extraction temperature and solid-liquid ratio on the content of anthocyanins in the extract

2.2.2.5 提取溫度和提取時(shí)間的交互作用

提取溫度和提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響見圖9。

圖9 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響Fig.9 Effect of extraction temperature and extraction time on the content of anthocyanins in the extract

2.2.2.6 料液比和提取時(shí)間的交互作用

料液比和提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響見圖10。

圖10 料液比和提取時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響Fig.10 Effect of solid-liquid ratio and extraction time on the content of anthocyanins in the extract

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過軟件分析得出最佳工藝參數(shù)：乙醇濃度為59.7%，料液比為1∶21，提取時(shí)間為98.4 min，提取溫度為58.7 ℃，花色苷含量為1.20353 mg/g。以此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得花色苷含量為1.3392 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值接近，說明可以用此模型來優(yōu)化紫薯花色苷的提取工藝條件。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)紫薯中花色苷的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，利用pH示差法測(cè)定花色苷的含量。其最佳工藝條件為提取時(shí)間98.4 min，提取溫度58.7 ℃，料液比1∶21，乙醇濃度59.7%。利用此工藝參數(shù)得到的花色苷含量為1.3392 mg/g，結(jié)果與理論值相似，此工藝參數(shù)可為天然色素的研究提供理論依據(jù)。