俞詩源,何玲慧,朱嘉寧,陳 誠,王小勇*
(西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州 730070)
海洛因(Heroin),學名二乙酰嗎啡(Diacetylmorphine hydrochloride),具有嗎啡的鎮(zhèn)痛和麻醉功能,易成癮.海洛因溶于水,脂溶性強,吸收、擴散快,進入體內(nèi)作用強、起效快,能很快透過血腦屏障與腦內(nèi)相應的受體結(jié)合而產(chǎn)生強烈的毒性反應.海洛因可導致呼吸抑制引起腦缺血缺氧,發(fā)生腦水腫而致神經(jīng)元損傷和消失[1].如果妊娠期女性或哺乳期女性吸食海洛因有可能影響胎兒或嬰幼兒的生長發(fā)育,如果子宮內(nèi)海洛因暴露可引起新生兒發(fā)育遲緩和神經(jīng)行為損傷,導致機體認知行為缺陷[2-3].
有研究顯示海洛因可使小鼠下丘腦和海馬組織結(jié)構(gòu)受損[4],但阿片類毒品是否通過母鼠胎盤影響仔鼠小腦組織結(jié)構(gòu)和抗氧化應激系統(tǒng)鮮有研究.為了研究妊娠期女性或哺乳期女性吸食興奮劑對嬰幼兒小腦組織結(jié)構(gòu)及抗氧化酶活力的影響,文中以昆明小鼠為模型,給孕鼠注射不同劑量的海洛因溶液,通過觀察其仔鼠小腦組織結(jié)構(gòu)和過氧化氫酶活性以及谷胱甘肽、丙二醛含量的變化,分析探討孕鼠使用興奮劑后對仔鼠器官功能的影響.
鹽酸海洛因(甘肅省公安廳提供)用蒸餾水配制成2,4和6 g·L-1濃度梯度的水溶液(根據(jù)小鼠半數(shù)致死劑量和成癮劑量配制而成[4]),4 ℃下保存?zhèn)溆?,谷胱甘?GSH)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所.
選昆明小鼠96只(蘭州大學醫(yī)學動物中心提供,體重30~40 g),按雌雄小鼠1∶1合籠交配,次日早晨做雌鼠陰道檢查,出現(xiàn)陰栓或精子涂片觀察到精子即記為妊娠第1 d.48例受孕小鼠隨機分為4組(對照組和海洛因1,2,3組,每組12只).各海洛因組孕小鼠從受孕第9天開始腹腔分別注射2,4,6 g·L-1的海洛因溶液0.2 mL,每天2次(9:30,16:30),直到孕鼠分娩后第15 d,對照組注射等量生理鹽水.分別在仔鼠出生后第5,10,15 d用電子天平稱量仔鼠體重后,斷頭處死[5],再迅速取仔鼠小腦在預冷的生理鹽水中漂洗后稱重,左半小腦入-20 ℃冰箱凍存,右半小腦入15%的福爾馬林液中固定備用.
分別取上述凍存的各組仔鼠小腦組織塊,精確稱重后,滴加小腦組織重量9倍的生理鹽水,冰浴勻漿5 min,制成10%的組織勻漿,用高速冷凍離心機(TGL.16 M型,Beckman公司,美國)3 000 r·min-1離心10 min,用微量移液器吸取上清液,按照試劑盒的操作要求,用V-5000可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)在420,405,532 nm檢測GSH、CAT及MDA的吸光度值.
將福爾馬林液中固定的各組仔鼠小腦組織塊常規(guī)石蠟包埋,連續(xù)切片(厚度6 μm),HE染色,光學顯微鏡(Nikon HFX-ⅡA)下觀察并攝片.
用SPSS 15.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析,結(jié)果以均值±標準差表示.
由圖1和圖2(不同小寫字母表示組間差異顯著,下同)可知,孕鼠注射海洛因后,仔鼠的體重、小腦重均有不同程度降低.海洛因劑量越大,仔鼠體重、小腦重下降越多,與對照組相比差異顯著(P<0.05).由圖3知,孕鼠注射海洛因后,仔鼠出生5 d時小腦指數(shù)略有升高,但10 d,15 d時均低于對照組(P<0.05).
圖1 海洛因?qū)ψ惺篌w重的影響
由圖4~6可知,孕鼠注射海洛因后,仔鼠小腦組織CAT活性及GSH含量均有不同程度的降低,與對照組相比差異顯著(P<0.05),而仔鼠小腦組織MDA含量則升高,與對照組相比差異顯著(P<0.05).
圖2 海洛因?qū)ψ惺笮∧X重的影響
圖3 海洛因?qū)ψ惺笮∧X指數(shù)的影響
圖4 海洛因?qū)ψ惺笮∧X組織過氧化氫酶活性的影響
圖5 海洛因?qū)ψ惺笮∧X組織谷胱甘肽含量的影響
圖6 海洛因?qū)ψ惺笮∧X組織丙二醛含量的影響
給孕鼠注射海洛因后對仔鼠小腦組織結(jié)構(gòu)的影響見圖7.研究結(jié)果顯示,對照組仔鼠小腦組織結(jié)構(gòu)完整清晰,界限分明,細胞排列整齊,染色正常(圖7A).孕鼠連續(xù)注射海洛因后,仔鼠小腦組織出現(xiàn)不同程度的病理性變化,細胞排列疏松而凌亂,細胞界限不清,浦肯野細胞形態(tài)不規(guī)則,出現(xiàn)細胞核固縮、凝集等異常改變或細胞空泡化和凋亡等現(xiàn)象(圖7B~D).
A.對照組10 d小腦皮層,HE染色,下同;B.2 g·L-1海洛因組10 d小腦皮層;C.4 g·L-1海洛因組10 d小腦皮層;D.6 g·L-1海洛因組15 d小腦皮層, 標尺=30 μm;ML.分子層;PC.浦肯野細胞層;GC.顆粒細胞層,標尺=30 μm
圖7 仔鼠小腦組織結(jié)構(gòu)的變化
Fig 7The changes of cerebellum histological structure in newborn mice
小腦參與調(diào)節(jié)軀體平衡和肌肉張力、協(xié)調(diào)機體的隨意運動,如果損傷小腦,機體就會出現(xiàn)供給失調(diào)、步態(tài)不穩(wěn)等多種癥狀[6],海洛因作用于阿片受體通過釋放內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)或形成復合物,可造成腦部多個區(qū)域損傷[7].長期使用興奮劑機體內(nèi)分泌系統(tǒng)及其功能將受到極大的影響,激素分泌受到抑制,造成機體生長遲緩[7],影響動物下丘腦攝食中樞的發(fā)育及功能,影響動物的食欲,導致食量減少,影響機體的發(fā)育和體重及器官重量[8].本實驗各期海洛因組仔鼠體重和小腦重均低于對照組,可能是因為海洛因通過胎盤屏障或乳汁進入仔鼠體內(nèi),再通過血腦屏障,直接作用于發(fā)育中的神經(jīng)細胞,影響神經(jīng)細胞的發(fā)育和仔鼠的行為,導致小鼠興奮性增強,疲勞感消失,睡眠減少,活動量加大,增加了機體物質(zhì)的消耗,使得動物生長遲緩,海洛因的毒性作用亦可能干擾了體內(nèi)能量代謝過程,造成代謝紊亂[9],影響動物的食欲,使得動物營養(yǎng)物質(zhì)攝入不足,導致體重和器官重量下降及器官指數(shù)下降.
GSH、CAT是機體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分.CAT具有清除氧自由基、保護細胞免受氧化損傷的作用,GSH可與H2O2反應生成H2O,通過減少H2O2含量來消除·OH的生成,對機體細胞結(jié)構(gòu)和功能完整有重要的保護作用.MDA是脂質(zhì)過氧化反應過程中不飽和脂肪酸氧化分解釋放出的反應性醛,可嚴重破壞細胞膜結(jié)構(gòu),導致細胞腫脹、壞死,其含量的高低反映機體細胞遭受自由基攻擊的程度[14].海洛因、可卡因及安非他明等可誘導細胞凋亡的發(fā)生,引起神經(jīng)細胞變性、壞死[7,15,16].有研究顯示麻黃素可使肺組織[17]、心肌細胞[18]、肝[19]、卵巢[20]、腎[21]組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷使組織中的抗氧化物酶活性降低,MDA含量升高.本實驗結(jié)果顯示,給孕鼠注射海洛因后仔鼠小腦組織CAT活力和GSH含量下降,MDA含量上升,表明孕鼠注射海洛因影響仔鼠小腦組織的抗氧化能力,會影響小腦的結(jié)構(gòu)與功能.
海洛因可與體內(nèi)內(nèi)源性阿片樣物質(zhì)競爭結(jié)合阿片受體,如果長時間使用海洛因會導致機體興奮劑依賴.海洛因可通過血腦屏障,直接抑制呼吸中樞,造成機體呼吸抑制,導致機體缺氧,出現(xiàn)全身缺血缺氧,促使機體器官損傷,損害腦細胞,影響人的學習、記憶、情感、情緒等功能活動[22-24],有研究顯示麻黃素可使小鼠下丘腦、海馬[25]、大腦額葉[26]組織結(jié)構(gòu)受損.本實驗顯示孕鼠注射海洛因影響仔鼠的體重和小腦重量及小腦指數(shù),仔鼠小腦組織出現(xiàn)不同程度的病理性變化,細胞排列疏松而凌亂,細胞界限不清,浦肯野細胞形態(tài)不規(guī)則,出現(xiàn)細胞核固縮、凝聚等異常改變或細胞空泡化和凋亡現(xiàn)象等,這可能是孕鼠注射海洛因后,后者通過胎盤屏障或乳汁進入仔鼠體內(nèi)影響了仔鼠腦的結(jié)構(gòu)與功能,表明母鼠使用海洛因影響仔鼠小腦的組織結(jié)構(gòu).
綜上所述,母鼠注射海洛因,可能通過胎盤屏障或乳汁進入仔鼠體內(nèi),再通過血腦屏障,直接作用于發(fā)育中的神經(jīng)細胞,使仔鼠機體重量、器官重量及器官指數(shù)降低,影響仔鼠腦組織抗氧化酶活性,對仔鼠腦組織有明顯的損傷作用,其具體機制有待進一步研究和探討.