劉金蓉,李 映,田平芳,李可意,葛喜珍,*

(1.北京聯(lián)合大學生物化學工程學院,北京 100023; 2.北京化工大學生命科學與技術(shù)學院,北京 100029; 3.生物質(zhì)廢棄物資源化利用北京市重點實驗室,北京 100023)

沼液是禽畜糞便等有機物經(jīng)厭氧發(fā)酵的殘留液體[1]。沼液營養(yǎng)豐富,含豐富的氮、磷、鉀、氨基酸、微量元素、B族維生素、多種水解酶、有機酸和腐植酸等生物活性物質(zhì),具抑菌和抗逆等功效[2]。研究發(fā)現(xiàn),沼液與化肥配施時,能明顯提高油菜產(chǎn)量和品質(zhì)[3];果樹灌溉沼液不僅能促進葉片生長,且果實膨大,品質(zhì)明顯改善[4];沼液作葉面肥噴施作物,葉片變厚、葉綠素含量增加,光合作用增強[5]。此外,沼液作葉面噴肥可防治病蟲害,減少農(nóng)藥使用和農(nóng)藥殘留[6],已有報道[7],沼液對糧食、經(jīng)濟作物、花卉、水果和蔬菜等24種作物中的40種病害具有一定的防治效果。雖沼液用途廣泛,但部分沼液重金屬超標、營養(yǎng)成分不完善[8-9],不能被有效利用,如何去除沼液中重金屬、合理應(yīng)用沼液是廢棄物利用的重要研究方向。

小檗堿是從黃連、黃柏等植物中提取的異喹啉類生物堿[10],對多種G+、G-細菌、絲狀真菌和酵母菌以及原蟲均具抑制作用[11-12],對多種真菌和細菌性病害甚至對畜牧動物有抑菌、消炎活性,對蚜蟲、螨類等具有防治活性,能清除田間雜草[13-15]。作為廣譜農(nóng)業(yè)殺菌劑,小檗堿環(huán)境相容性好、安全、對非靶標生物毒性低、植物病原真菌對其不易產(chǎn)生抗性、在自然環(huán)境中降解快,在無公害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和綠色食品生產(chǎn)中有廣闊的應(yīng)用前景[16]。

肥料和農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)不可缺少的重要生產(chǎn)資料,對于減少病蟲害、提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)有著重要作用,農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一般將二者分開施用,而現(xiàn)代農(nóng)業(yè)要求農(nóng)田作業(yè)盡量省時、高效、節(jié)約成本[17]。目前關(guān)于沼液與小檗堿復(fù)配的藥肥一體化應(yīng)用研究未見報道。本研究在沼液中添加氮、磷、鉀礦質(zhì)養(yǎng)分,將之與小檗堿配合,制備沼液藥肥一體化水劑,并通過抑菌和植物生長試驗初步證明此復(fù)合藥肥的抑菌效果和肥效,為環(huán)境友好型沼液復(fù)合藥肥一體化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小檗堿 西安科慧生物有限公司;磁石、石膏 安國長安中藥材有限公司;沼液 由北京郊區(qū)農(nóng)場提供;小白菜(綠星青菜品種) 中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所;黃腐酸 上海伊卡生物技術(shù)有限公司;尿素、磷酸二氫鉀 北京化工廠;硝酸鉀 天津市福晨化學試劑廠;番茄灰霉病菌 由河北農(nóng)業(yè)大學植保學院楊文香教授提供。

PDA培養(yǎng)基:土豆300 g;葡萄糖20 g;瓊脂15 g;蒸餾水1000 mL。

MS105電子天平 北京北方首衡電子科技有限公司;85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;HC014-11-018-01(X)立式滅菌鍋 上海東亞壓力容器制造有限公司;LRH-150生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;ZHJH-C1106C超凈臺 上海智城分析儀器制造有限公司;DHG-9023A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海益恒實驗儀器有限公司;PS-40A超聲波清洗機 深圳市超藝達科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 沼液凈化 將磁石和石膏分別粉碎,過80目篩,備用。取2 L沼液原液,將磁石和石膏粉末加入沼液,磁石和石膏的投加量分別為60、70 mg,以260 r/min攪拌26 s,然后以50 r/min 慢速攪拌25 min,沉淀60 min,過濾,取上清得溶劑I。向溶劑I中加入140 g硅藻土,以50 r/min攪拌30 min,沉淀35 min,過濾,取上清843 mL,得含沼液的溶劑II即為試驗試樣。

參照國家標準(NY/T 1973-2010水溶肥料水不溶物含量和pH的測定;NY/T 1976-2010水溶肥料有機質(zhì)含量的測定;NY/T 1977-2010水溶肥料總氮、有效磷、鉀含量的測定;NY/T 1974-2010水溶肥料銅、鐵、錳、鋅、硼、鉬含量的測定;NY/T 1978-2010肥料汞、砷、鎘、鉛、鉻含量的測定)取三次樣品檢測沼液凈化前后的成分及基本理化性質(zhì)的變化。

1.2.2 水溶肥料的制備 以沼液溶劑II為母液,選用尿素、磷酸二氫鉀、硝酸鉀、黃腐酸為供N、P2O5、K2O和腐植酸的原料[18],以“含腐殖酸水溶肥料(大量元素型)(NY1106-2010)”為標準,設(shè)計四因素三水平正交試驗(因素水平排列見表1),以水不溶物含量為指標,篩選水溶肥料最佳配方,并按此配方制備水溶肥料。測定方法參照NY/T 1973-2010水溶肥料水不溶物含量。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.2.3 沼液藥肥一體化水劑的制備 采用超聲后靜置法[19]測定常溫下小檗堿在水溶肥料中的溶解度(W/V),根據(jù)測得的溶解度確定小檗堿的添加量,將小檗堿與水溶肥料配合制備成沼液藥肥一體化水劑,該水劑由中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所土壤肥料測試中心檢測其中N、P、K等的含量。

1.2.4 小檗堿水劑和沼液藥肥一體化水劑對番茄灰霉病菌毒力的影響 設(shè)置小檗堿水劑濃度梯度分別為32、64、128、256、512 μg/mL。配制上述濃度的加藥(即加小檗堿)PDA培養(yǎng)基,用直徑0.8 cm打孔器取培養(yǎng)96 h的番茄灰霉病菌菌餅,接種至上述PDA固體培養(yǎng)基,每處理重復(fù)3次,28 ℃培養(yǎng)。番茄灰霉病菌培養(yǎng)60 h后用十字交叉法測量菌落直徑,按照式(1)計算抑制率[20-21]。根據(jù)機率值換算表,將抑制百分率換算成抑制機率值。以試驗中設(shè)定的濃度對數(shù)為橫坐標,抑制機率值為縱坐標,計算毒力回歸方程和半數(shù)最大效應(yīng)濃度(Concentration for 50% of maximal effect,EC50)。

沼液藥肥一體化水劑中小檗堿濃度梯度為8、16、32、64 μg/mL。實驗方法同上。

抑制率(%)=100×(空白組菌落直徑-加藥處理組菌落直徑)/空白組菌落直徑式(1)

1.2.5 沼液藥肥一體化水劑對白菜生長的初步試驗 本研究采用盆栽種植白菜,基質(zhì)由蛭石、珍珠巖、草炭以1∶1∶2的比例混配,土壤組成按照壤土、基質(zhì)、有機肥以1∶3∶1混勻即可[22]。試驗設(shè)置不同濃度沼液藥肥一體化水劑,共設(shè)6個處理,即水劑稀釋50、150、300、400、500倍噴施及對照組(清水)。待供試白菜第3片真葉長出時開始第一次追肥,之后毎隔5 d追肥一次,追施第3次后采收[23]。測定指標包括:株高和生物量,株高測定:每個處理隨機抽取6株,在營養(yǎng)生長盛期,用直尺測定植株的株高,株高測定時高度統(tǒng)一為從根莖連接處到頂端分支處;生物量測定:在生殖生長盛期采用電子秤測定不同處理的各植株地上部干重(60 ℃烘干)等。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel整理數(shù)據(jù),采用SPSS Statistics軟件處理數(shù)據(jù),并進行顯著性分析,顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 沼液凈化結(jié)果

沼液凈化前后的成分及基本理化性質(zhì)實驗結(jié)果如表2所示。

表2 沼液凈化前后的成分及基本理化性質(zhì)Table 2 Composition and basic physical and chemical properties of biogas slurry before and after purification

沼液凈化后,其中的鐵、錳、鋅含量增加,銅離子及重金屬離子含量明顯降低。推測鐵、錳、鋅含量增加與磁石、石膏和硅藻土成分有關(guān):磁石除主成分Fe元素含量高外,還含有豐富的Zn、Mn、Cu、Co、Ca等元素[24];石膏中除Ca元素外,主要含有Sr、Al、Fe、Mg、K等元素[25];硅藻土的成分中80%以上為SiO2·nH2O,也含有少量的Al、Fe、Ca、Mg、Na、K、P等[26]。而銅離子及重金屬離子含量降低與石膏和硅藻土的性狀有關(guān):石膏比表面積大,硅藻土孔隙率高、比表面積大、吸附性能強、性質(zhì)穩(wěn)定且無二次污染[27],而且目前應(yīng)用硅藻土處理銅離子和重金屬離子已有報道[28-30]。

2.2 水溶肥料的配方篩選結(jié)果

水溶肥料配方篩選結(jié)果見表3。由極差分析結(jié)果可知,各個因素影響的主次順序是磷酸二氫鉀、硝酸鉀、尿素、黃腐酸。由正交試驗結(jié)果可知,最佳配方組合為A2B2C1D3,即尿素用量17%,磷酸二氫鉀用量9%,硝酸鉀用量10%,黃腐酸用量8%,沼液補至100%。

表3 正交試驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal tests

2.3 沼液藥肥一體化水劑檢測結(jié)果

實驗測定25 ℃下小檗堿在最佳配方中的溶解度為0.014%±0.002%(W/V),在最佳配方中添加0.01%小檗堿制成沼液藥肥一體化水劑,其養(yǎng)分含量檢測結(jié)果見表4,由表4可知,制備的沼液藥肥一體化水劑N、P2O5、K2O含量分別為85.1、41.8、78.7 g/L,符合NY1106-2010標準，其中N、P2O5、K2O總和=205.6 g/L≥200 g/L,能滿足作物對養(yǎng)分的需求。此沼液藥肥一體化水劑中,藥和養(yǎng)分的比例是1∶2056。

表4 沼液藥肥一體化水劑檢測結(jié)果Table 4 Test results of water soluble fertilizer

2.4 小檗堿水劑對菌毒力的影響

小檗堿水劑濃度梯度為32、64、128、256、512 μg/mL(圖1),通過測定不同濃度梯度小檗堿水劑對番茄灰霉病菌的抑制率(表5),得毒力回歸方程y=0.9124x+3.54439,決定系數(shù)R2=0.99333,當抑菌率為50%時,機率值Y=5.0000,小檗堿水劑抑制番茄灰霉病菌的EC50為398.11 μg/mL。

表5 小檗堿對番茄灰霉病菌的抑制率(60 h)Table 5 Inhibition rate of berberine on Botrytis cinerea(60 h)

圖1 小檗堿對番茄灰霉病菌的抑制效果Fig.1 Effect of berberine on inhibition of Botrytis cinerea注:A1:空白對照;B1:小檗堿濃度32 μg/mL; C3:小檗堿濃度64 μg/mL;D2:小檗堿濃度128 μg/mL; E2:小檗堿濃度256 μg/mL;F1:小檗堿濃度512 μg/mL。

2.5 沼液藥肥一體化水劑中小檗堿對菌毒力的影響

沼液藥肥一體化水劑中小檗堿濃度梯度為8、16、32、64 μg/mL(圖2),該水劑抑制番茄灰霉病菌的EC50為12.12 μg/mL。

圖2 沼液復(fù)合殺菌對番茄灰霉病菌的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of compound disinfection of biogas slurry on Tomato Gray Mold注:A1:空白對照;B2:小檗堿濃度8 μg/mL; C2:小檗堿濃度16 μg/mL;A2:小檗堿濃度32 μg/mL; E2:小檗堿濃度64 μg/mL。

對毒力測定結(jié)果進行分析,沼液藥肥一體化水劑的EC50與小檗堿水劑比較,降低了很多,要實現(xiàn)50%的抑菌率,沼液藥肥一體化水劑中小檗堿用量僅為小檗堿水劑中的3.04%,明顯減少了小檗堿用量。沼液藥肥一體化水劑不僅能增強小檗堿作為生物農(nóng)藥的殺菌藥效,且實現(xiàn)水肥一體化,大大降低了使用成本。

2.6 沼液藥肥一體化水劑對白菜生長的影響

由圖3可知,沼液藥肥一體化水劑隨著稀釋倍數(shù)的增加,株高増長量呈先增加后下降的趨勢,在稀釋300倍時增長量最大,為14.36 cm;稀釋150倍時,增長量次之,為13.83 cm;稀釋400倍時,株高增長量為第三,增長值為12.71 cm。經(jīng)方差分析可知,該水劑稀釋300倍和150倍時對株高的影響顯著大于稀釋400倍(p<0.05),而稀釋300倍和150倍的處理間差異不顯著(p>0.05)?？赡苁窍♂?00倍時營養(yǎng)元素足夠植株生長,稀釋150倍時,營養(yǎng)元素也未過剩。而稀釋50倍時營養(yǎng)元素過多,稀釋400倍和500倍時由于稀釋度過高,導致肥料中可用的N、P、K濃度太低,因而不足植株生長發(fā)育所需,使得生長效果不及稀釋300倍時效果好。

圖3 不同處理對白菜生長的影響Fig.3 Effects of different treatments on the growth of Chinese cabbage注:圖中不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05), 相同小寫字母表示差異不顯著(p>0.05),圖4同。

由圖4可知,對于白菜的地上部干重來說,沼液藥肥一體化水劑稀釋150倍時最高,稀釋300倍時次之,稀釋400倍時第三,依次是:2.61、1.62、1.44 g,可能是隨著施肥量減少,作物養(yǎng)分減少,而施用稀釋50倍的沼液藥肥一體化水劑幾乎無增產(chǎn)作用,推測是由于肥料的過量施用影響了作物對元素的有效吸收,同時肥料中過量的鹽分集結(jié)容易使土壤結(jié)塊,養(yǎng)分失衡,阻礙作物對養(yǎng)分物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)化[23]。經(jīng)方差分析可知,該水劑稀釋150倍對地上部干重的影響顯著大于稀釋300倍和400倍(p<0.05)。

圖4 不同處理對白菜生物量的影響Fig.4 Effects of different treatments on biomass of Chinese Cabbage

綜合分析各稀釋倍數(shù)對白菜株高和生長量的影響,沼液藥肥一體化水劑稀釋150倍即養(yǎng)分含量為1.67 g/L時有助于白菜增產(chǎn)。

3 結(jié)論

將磁石和石膏與沼液混合,再加硅藻土凈化、沉淀,能明顯增加沼液中鐵、錳、鋅含量增加,銅離子及重金屬離子含量明顯降低。本研究首次制備添加小檗堿的沼液藥肥一體化水劑,其最佳配比及原輔料為:小檗堿0.01%,尿素17%,磷酸二氫鉀9%,硝酸鉀10%,黃腐酸8%,沼液補至100%,制備的藥肥一體化配方N∶P2O5∶K2O質(zhì)量比:8.51∶4.18∶7.87。研究發(fā)現(xiàn)該水劑對番茄灰霉病菌有較強的抑制作用,EC50為12.12 μg/mL,為小檗堿水劑EC50的3.04%。白菜施用150倍稀釋液即養(yǎng)分含量為1.67 g/L能有效加速植株生長。該研究為提高沼液抑菌效果和肥效,開發(fā)以沼液和小檗堿為主要原料的藥肥一體化水劑提供科學參考。