蘇懷軒 樊友凌 江偉航 潘杰慈 黃政通

廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 511400

布比卡因（bupivacaine）是一種氨基酰胺類的局部麻醉藥[1]，常用于臨床局部麻醉和止痛，但有報道顯示布比卡因會引起神經(jīng)細胞凋亡[2]，對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，進而造成患者運動或感覺障礙，嚴重影響了患者生活。隨著局麻藥在臨床手術(shù)中廣泛的使用，其周圍神經(jīng)毒性逐漸引起人們的重視，其中以短暫神經(jīng)綜合征（transient neurologic syndrome，TNS）、馬 尾 綜 合 征（caude equina syndrom，CES）最為常見。局麻藥神經(jīng)損傷的防治成為臨床麻醉中的重要課題。姜黃素是一種低分子量的多酚化合物[3]，是中藥姜黃的主要活性成分，具有多方面的藥理作用[4]。SH-SY5Y細胞是人神經(jīng)母細胞瘤細胞，被廣泛運用于構(gòu)建神經(jīng)細胞損傷模型，研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制和預(yù)防治療手段[5]。

抗氧化蛋白PRDX3屬于硫氧還蛋白過氧化物酶家族[6]，位于線粒體基質(zhì)，主要作用是清除線粒體內(nèi)過氧化物，在細胞抗氧化防御體系及維持線粒體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用[7]。

本科研小組通過前期實驗構(gòu)建了布比卡因損傷人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞模型[8]，發(fā)現(xiàn)姜黃素預(yù)處理12h能減輕布比卡因所致的SH-SY5Y細胞凋亡[9]，并通過細胞形態(tài)、細胞活力和凋亡率等指標的變化明確姜黃素的神經(jīng)保護作用[10]，同時通過對線粒體途徑介導(dǎo)的SH-SY5Y細胞凋亡的相關(guān)研究探討抗氧化蛋白PRDX3的作用及其可能機制，發(fā)現(xiàn)PRDX3的高表達可能是導(dǎo)致這一保護作用的機制，為臨床防治局麻藥神經(jīng)損傷提供了新的理論依據(jù)和方法。

1 資料與方法

1.1 儀器與材料

（1）儀器

FACSsort流式細胞儀（美國BD 公司），BX260型熒光顯微鏡、CK30 型倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；Sunrise RC+TW型遙控酶標分析儀（奧地利Tecan 公司）。

（2）細胞株

人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞購自中國科學(xué)院上海細胞所。

（3）試劑和藥品

姜黃素、布比卡因、MTT、Hoechst33258 熒光染料（美國sigma公司）；

1.2 方法

（1）SH-SY5Y細胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細胞在含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基、5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)。

（2）布比卡因損傷人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞模型的構(gòu)建

體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，設(shè)置布比卡因濃度梯度，分為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mM 組，MTT 檢測細胞活力，確定布比卡因?qū)H-SY5Y的損傷的IC50值，本實驗中我們選擇1.5mM布比卡因建立SHSY5Y細胞損傷模型。

（3）實驗分組

將細胞按照條件不同分為四組：（1）空白對照組（con）：未經(jīng)過處理的；（2）模型對照組：加入1.5mM 布比卡因孵育 24h（B）；（3）1μM 姜黃素預(yù)處理 12h（C）；（4） 1μM 姜黃素預(yù)處理 12h后，加入1.5MM布比卡因孵育24h（C+B）。

（4）MTT法測定細胞活力

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，計數(shù)后細胞懸液按每孔100μL加入96 孔培養(yǎng)板。48h 后，在有或沒有布比卡因的培養(yǎng)液中繼續(xù)孵育4h，每孔加入MTT溶液（5g/L）20μL，再繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸出上清，每孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO），振蕩10min，使沉淀充分溶解，用酶標儀在570 nm波長處測定吸光度，計算細胞活力。

（5）流式細胞（FCM）檢測各組SH-SY5Y 細胞凋亡率

流式細胞儀（FACSsort，美國Becton Dinkinson公司）檢測，CellQuest 軟件分析細胞凋亡率。

（6）Hoechst33258 熒光染料染色觀察細胞核形態(tài)的改變

（7）逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測PRDX3 mRNA水平變化

采用Trizol一步法分別提取上述四組里SHSY5Y細胞的總RNA。結(jié)果觀察：分別取5μL擴增產(chǎn)物加樣至1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用GDS 凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝結(jié)果。

（8）Western blot 檢 測 PRDX3，Bax，Bcl-2，caspase-9等蛋白表達量變化

蛋白質(zhì)提取，BCA法蛋白定量試劑盒測蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體標記，曝光等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 實驗結(jié)果

2.1 布比卡因抑制SH-SY5Y細胞活力和誘導(dǎo)細胞凋亡

體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，分為六組，對照組未經(jīng)藥物處理，SH-SY5Y 與不同濃度（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mM）的布比卡因一起培養(yǎng)24h，這五組記為 B0.5，B1.0，B1.5，B2.0，B2.5。MTT 檢測結(jié)果顯示布比卡因處理24h后，各個實驗組中不同濃度的布比卡因?qū)H-SY5Y細胞活力均有影響，具有顯著抑制作用，細胞活力的降低與布比卡因濃度的增加呈正相關(guān)。B0.5～B2.5組別細胞活力分別下降至85%，72%，50%，42%和24%（見圖1）。檢測及計算后得知，布比卡因誘導(dǎo)細胞死亡的IC50值為1.48mM，因此本實驗選擇布比卡因濃度為1.5mM建立神經(jīng)細胞損傷模型，進行后續(xù)實驗。

布比卡因處理24h后，經(jīng)Hoechst33258 熒光染料染色，可見具有凋亡征象的細胞，細胞形態(tài)變圓、變小、收縮，胞核深染、固縮，細胞質(zhì)也出現(xiàn)收縮現(xiàn)象。對照組正常細胞則細胞膜完整、光滑，細胞核正常。

實驗結(jié)果經(jīng)流式細胞術(shù)結(jié)果顯示經(jīng)過布比卡因處理后的細胞凋亡率顯著提高，稀薄凋亡率和布比卡因的濃度呈正相關(guān)，空白對照組凋亡率為5.01%，B0.5～B2.5組別細胞凋亡率分別為19.22%，25.34%，38.18%，52.56%和65.17%，見表1。

因此，我們發(fā)現(xiàn)布比卡因?qū)H-SY5Y細胞有損傷作用，濃度升高，損傷程度加深。選擇1.5mM濃度布比卡因建立細胞模型。

圖1 布比卡因?qū)H-SY5Y細胞活力的抑制作用

表1 不同濃度布比卡因?qū)H-SY5Y細胞生長的影響（± s）

表1 不同濃度布比卡因?qū)H-SY5Y細胞生長的影響（± s）

布比卡因濃度（mM） n 凋亡細胞百分比（%）0 3 5.01±1.23 0.5 3 19.22±1.68 1.0 3 25.34±5.12 1.5 3 38.18±4.35 2.0 3 52.56±2.98 2.5 3 65.17±4.19 F 64.428 P 0.000

2.2 姜黃素減輕布比卡因?qū)H-SY5Y細胞活力的抑制和細胞凋亡率

體外培養(yǎng)SH-SY5Y細胞，分為如下幾組：對照組Con（未經(jīng)任何處理的細胞），B組（布比卡因濃度 1.5mM），B+C0.5，B+C1.0，B+C2.0，B+C5.0，B+C10.0（布比卡因處理細胞之前加入姜黃素預(yù)處理12h，姜黃素濃度分別為 0.5，1.0，2.0，5.0，10.0μM。姜黃素對各個實驗組SH-SY5Y細胞活力均有影響（見表2）。其中低濃度組別1μM姜黃素明顯減少了布比卡因?qū)е碌募毎盍档?，高濃度組別姜黃素對于神經(jīng)細胞有毒害作用，無保護作用。確定姜黃素濃度為1μm作為后續(xù)試驗濃度。

姜黃素預(yù)處理后的細胞凋亡率約為20%，而不加姜黃素的布比卡因損傷細胞的細胞凋亡率為30%（見表3）。以對照組細胞活力為100%，姜黃素處理的相對細胞活力約為89%，而布比卡因組細胞活力為71%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見表2），根據(jù)細胞凋亡率和細胞活力數(shù)據(jù)的對比證明，姜黃素可以減輕布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷。

2.3 姜黃素預(yù)處理后，PRDX3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)

RT-PCR結(jié)果顯示：與空白對照組相比，姜黃素預(yù)處理組（B+C）SH-SY5Y細胞PRDX3轉(zhuǎn)錄水平 略有下調(diào)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而布比卡因單獨處理組（C）PRDX3 mRNA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖2）。

表2 不同濃度姜黃素對SH-SY5Y細胞活力的影響

表3 姜黃素對SH-SY5Y細胞凋亡的影響（± s）

表3 姜黃素對SH-SY5Y細胞凋亡的影響（± s）

布比卡因濃度（mM） （μM） n 凋亡細胞百分比（%）0 0 3 9.67±3.52姜黃素濃度1.5 0 3 34.51±5.55 1.5 1.0 3 19.54±6.98 0 1.0 3 12.67±4.33 F 18.246 P 0.000

圖2

2.4 姜黃素預(yù)處理后，PRDX3蛋白質(zhì)表達量增高

Western 印跡結(jié)果顯示：與對照組（con）相比，姜黃素預(yù)處理組（B+C）SH-SY5Y細胞表達PRDX3略有減少，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，而布比卡因單獨處理組（C）PRDX3蛋白水平明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖3）。

圖3

3 討論

在本研究中，我們展示了姜黃素在布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性中的保護作用。用1μM姜黃素預(yù)處理顯著增加布比卡因處理的細胞中的PRDX3的蛋白表達量和Akt磷酸化。我們的研究結(jié)果表明，姜黃素通過PRDX3和Akt磷酸化水平依賴性機制減弱布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[11]。姜黃素可能是臨床上應(yīng)用局麻藥引起神經(jīng)毒性的潛在神經(jīng)保護劑。

人神經(jīng)母細胞瘤細胞系（例如SH-SY5Y）與真正的神經(jīng)元細胞不同，具有明顯的腫瘤細胞特征。 因此，SH-SY5Y細胞被廣泛用于研究局麻藥的神經(jīng)毒性[12-13]，因為它們可以模擬神經(jīng)元的生物學(xué)特性。 因此，SH-SY5Y細胞被用于我們的神經(jīng)元損傷的體外模型。 布比卡因濃度為1.5mM，等于0.045%，用于本研究[14]。雖然此濃度不在臨床使用的濃度范圍內(nèi)，但1.5mM布比卡因能顯著誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷，形態(tài)學(xué)變化和MTT測定結(jié)果已證明這一點[15]。我們的結(jié)果與之前的報道一致，布比卡因主要通過誘導(dǎo)壞死和凋亡來引發(fā)神經(jīng)元細胞損傷[16]。

姜黃素已用于中醫(yī)數(shù)千年，一般認為是安全的。在這項研究中，我們觀察到當SH-SY5Y細胞用它預(yù)處理12h時，1μM（大約0.4mg/mL）的姜黃素沒有任何細胞毒性并且阻止了布比卡因的毒性。當濃度增加到2，5，10μM時，我們發(fā)現(xiàn)姜黃素對布比卡因誘導(dǎo)的細胞損傷的神經(jīng)保護作用減弱或甚至消失。數(shù)據(jù)表明姜黃素對布比卡因毒性的保護作用是劑量依賴性的，需要進一步的研究來確定姜黃素的細胞毒性作用的相對貢獻。總之，我們的結(jié)果表明，低濃度的姜黃素預(yù)處理12h將有利于預(yù)防布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性。

抗氧化蛋白PRDX3屬于Peroxiredoxin抗氧化蛋白超家族，它是線粒體特有的過氧化物酶，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成后，轉(zhuǎn)運至線粒體，依賴硫氧化蛋白還原過氧化物在線粒體基質(zhì)內(nèi)清除線粒體過氧化物，從而減少ROS產(chǎn)生。已有研究證明，線粒體內(nèi)ROS的增加與局麻藥布比卡因?qū)е碌纳窠?jīng)損傷關(guān)系非常密切。我們的研究證明姜黃素能增強抗氧化蛋白PRDX3（Peroxiredoxin3）的表達。本實驗中，姜黃素能夠激活PRDX3表達，PRDX3表達水平增高后，細胞內(nèi)過多的氧自由基分子被清除，布比卡因誘導(dǎo)的細胞凋亡減少。我們發(fā)現(xiàn)姜黃素的抗氧化應(yīng)激作用通過增強PRDX3蛋白表達，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

已知與正常細胞相比，凋亡細胞通常具有顯著的線粒體膜電位去極化[17]。Dwm的丟失是線粒體相關(guān)的凋亡級聯(lián)中的關(guān)鍵早期事件，其導(dǎo)致線粒體通透性的轉(zhuǎn)變和細胞色素c和其他促細胞凋亡因子向胞質(zhì)溶膠的釋放[18-19]。因此，保持線粒體功能可以阻止線粒體依賴性細胞凋亡的激活。我們猜測Dwn可能參與姜黃素的神經(jīng)保護作用，姜黃素可能減輕布比卡因誘導(dǎo)的Dwm損失。此外，Akt抑制可能消除了姜黃素對布比卡因誘導(dǎo)的Dwm損失的保護作用。

許多研究表明，Akt是PI3-激酶下游的關(guān)鍵激酶，在不同的細胞應(yīng)激條件下神經(jīng)元的存活和死亡途徑中起著關(guān)鍵作用[20-22]。先前的報道顯示布比卡因降低Akt的磷酸化水平并導(dǎo)致Na2細胞，人腎細胞和小鼠C2C12成肌細胞中的細胞損傷。相反，增加Akt的磷酸化水平可減弱布比卡因誘導(dǎo)的損傷[23]。在本研究中，我們觀察到布比卡因降低Akt的磷酸化水平并導(dǎo)致細胞凋亡。這與以前的報道一致，即布比卡因誘導(dǎo)的人近端腎小管細胞凋亡與Akt活性的抑制有關(guān)[24]。我們觀察到Akt活化的阻斷降低了姜黃素對布比卡因挑戰(zhàn)的細胞保護作用?？傊?，我們的研究結(jié)果表明，激活A(yù)kt信號傳導(dǎo)介導(dǎo)了姜黃素對布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的神經(jīng)保護作用?？傊覀兊难芯拷Y(jié)果表明用姜黃素預(yù)處理SH-SY5Y細胞對布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性具有保護作用。

總而言之，這種細胞保護作用至少部分是通過增加PRDX3的蛋白表達量來介導(dǎo)的。如果我們從轉(zhuǎn)化的神經(jīng)母細胞瘤細胞的體外研究結(jié)果可以應(yīng)用于體內(nèi)的神經(jīng)元，那么這項研究提示了臨床工作者們將姜黃素作為潛在的治療布比卡因誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的藥物的可能性。