明 川，拓昊苑，陶 怡，于好強，李晚忱，付鳳玲

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 玉米研究所，四川 成都 611130)

脫落酸(Abscisic acid,ABA)是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及應(yīng)答逆境脅迫的重要激素[1-3]。近年來，在擬南芥上陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的PYR/PYL/RCAR蛋白(Pyra-bactin resistance 1/PYRl-like/regulatory compon-ents of ABA receptor)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2C(Serine/threonine protein phosphatase type 2C,PP2C)和蔗糖非酵解型蛋白激酶2(Sucrose non-fermenting protein kinase 2,SnRK2)分別是ABA的直接受體和第二、第三信使[4-13]。然而，SnRK2功能呈多樣化，在其接收PYR/PYL/RCAR和PP2C轉(zhuǎn)導(dǎo)的ABA信號并通過自體磷酸化激活后，催化眾多下游蛋白質(zhì)的磷酸化，最終通過不同的途徑調(diào)節(jié)植物對非生物逆境的抗性[12-15]。SnRK2可催化ABA響應(yīng)原件結(jié)合因子(ABA responsive element (ABRE) binding factors)的磷酸化，從而調(diào)節(jié)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)[12]。在擬南芥SnRK2.2、SnRK2.3雙缺突變體中，ABRE轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化水平隨SnRK2活性的下降而降低，導(dǎo)致啟動子含有ABRE元件的RD29B等抗逆相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)，SnRK2還可磷酸化激活慢陰離子通道蛋白SLAC1和鉀離子通道蛋白KAT1，誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉[19-21]。目前，除在擬南芥上用SnRK2.2、SnRK2.3、SnRK2.6三缺突變體鑒定出少數(shù)響應(yīng)ABA誘導(dǎo)的SnRK2底物蛋白外，對更多響應(yīng)ABA誘導(dǎo)的SnRK2底物蛋白知之甚少[16,22]。然而，通過對已知擬南芥SnRK2底物蛋白的同源性和保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，-RXXS-(RXXpS或LXRXXpS，其中S為絲氨酸，R為精氨酸，X為任意氨基酸)是SnRK2底物蛋白的保守磷酸化基序[23-25]。與擬南芥、水稻等模式植物相比，玉米基因組因大量重復(fù)和轉(zhuǎn)座序列的存在而更為龐大和復(fù)雜[26-27]。在玉米中，參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白質(zhì)家族各成員的結(jié)構(gòu)和功能可能呈現(xiàn)多樣化，而且缺少齊備的突變體，使其SnRK2(ZmSnRK2)下游底物蛋白的篩選鑒定更為困難[28]。目前，關(guān)于ZmSnRK2基因的研究僅在同源克隆、生物信息學(xué)分析、脅迫條件下表達(dá)差異、異源表達(dá)功能驗證等方面有少量報道[29-31]，并未見直接研究ZmSnRK2與下游底物蛋白互作對ABA誘導(dǎo)響應(yīng)的研究報道。為此，本研究以本課題組前期玉米磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定出的238個響應(yīng)ABA誘導(dǎo)且磷酸化水平上調(diào)的蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)[32]，將其與擬南芥已知的SnRK2底物蛋白的序列進行比對，并檢測SnRK2磷酸化保守基序(-RXXS-)的有無，預(yù)測可能的ZmSnRK2底物蛋白，并通過酵母雙雜交(Yeast two-hydrid, Y2H)驗證候選蛋白與ZmSnRK2家族成員的相互作用，以期揭示ZmSnRK2下游的ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進一步解析玉米中ABA介導(dǎo)非生物逆境抗性的分子機制。

1 材料與方法

1.1 響應(yīng)ABA誘導(dǎo)的ZmSnRK2底物蛋白的篩選

以本課題組前期磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定出的響應(yīng)ABA誘導(dǎo)且磷酸化水平上調(diào)的238個蛋白質(zhì)氨基酸序列為探針[33]，與已知的擬南芥SnRK2底物蛋白氨基酸序列進行本地Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)比對，篩選與已知擬南芥SnRK2底物蛋白同源的ZmSnRK2候選底物蛋白。另外，利用Motif-X軟件(http://motif-x.med.harvard.edu/motif-x.html)，從這238個蛋白中篩選包含保守基序-RXXS-的蛋白[23-25]。同時滿足上述兩項篩選條件的蛋白，即為預(yù)測的響應(yīng)ABA誘導(dǎo)的ZmSnRK2候選底物蛋白。

1.2 克隆ZmSnRK2基因及候選底物蛋白編碼基因

從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)和Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)數(shù)據(jù)庫檢索ZmSnRK2基因家族成員及編碼候選底物蛋白的基因序列，據(jù)其用Premier 5軟件(http://www.premierbiosoft.com/)設(shè)計PCR擴增引物，并在引物的5′端分別引入構(gòu)建Y2H表達(dá)載體所需的限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ識別位點(表1和2)。

表1 擴增玉米ZmSnRK2基因的PCR引物Table 1 PCR primers for amplification of ZmSnRK2 genes of maize

注：下劃線堿基CATATG、GAATTC、CTCGAG和GGATCC分別為NdeⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ和BamHⅠ識別位點。

Note:The underlined bases CATATG,GAATTC,CTCGAG and GGATCC indicate the recognition sites ofNdeⅠ,EcoR Ⅰ,XhoⅠ andBamH Ⅰ.

表2 擴增編碼玉米ZmSnRK2候選底物蛋白基因的PCR引物Table 2 PCR primers for amplification of encoding genes of candidate ZmSnRK2 substrate proteins of maize

注：下劃線堿基GAATTC和GGATCC分別為EcoRⅠ和BamHⅠ識別位點。

Note:The underlined bases GAATTC and GGATCC indicate the recognition sites ofEcoRⅠ andBamHⅠ.

取玉米模式自交系B73三葉期幼苗，用RNAiso Plus Kit(TaKaRa，大連)提取總RNA，加gDNA Eraser (TaKaRa，大連)去除可能的基因組DNA污染后，用PrimeScript?RT reagent Kit(TaKaRa，大連)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板，用高保真DNA聚合酶PrimeSTARTM HS DNA Polymerase(TaKaRa，大連)擴增ZmSnRK2基因家族成員和編碼候選底物蛋白基因的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)序列。PCR擴增產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen，北京)回收，3′端加A后亞克隆至pMD19-T質(zhì)粒，送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.3 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

依據(jù)引物的酶切位點，用相應(yīng)的酶分別雙酶切插入ZmSnRK2基因家族成員的克隆載體pMD19-T(TakaRa，大連)和Y2H捕獲載體pGADT7(豐輝生物，長沙)，用EcoRⅠ/BamHⅠ分別雙酶切插入編碼候選底物蛋白(Candidate substrate protein, Csd)基因的克隆載體pMD19-T和Y2H誘餌載體pGBKT7，酶切產(chǎn)物用2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用DNA回收試劑盒(Tiangen，北京)回收純化酶切產(chǎn)物。用T4 DNA連接酶(TaKaRa，大連)分別將ZmSnRK2基因的ORF序列與捕獲載體pGADT7及編碼候選底物蛋白基因的ORF序列與誘餌載體pGBKT7連接，構(gòu)建ZmSnRK2基因家族各成員的捕獲載體pGADT7-ZmSnRK2和含有編碼候選底物蛋白基因的誘餌載體pGBKT7-Csd。

1.4 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備

取酵母Y2H Gold菌株單菌落接種于YPDA液體培養(yǎng)基(蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L、葡萄糖20 g/L、腺嘌呤0.03 g/L，pH 5.8)，28 ℃培養(yǎng)至600 nm處吸光度(D600 nm)為0.6～0.8，轉(zhuǎn)接到300 mL 新鮮的YPDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.4～0.6，2 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞，用50 mL 1×TE緩沖液重懸細(xì)胞，重復(fù)洗滌2次，細(xì)胞沉淀用1.5 mL 1×TE/LiAc重懸。

1.5 自體磷酸化的檢測

在離心管中各加入100 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞和600 μL PEG400 LiAc溶液，分別加入各候選底物蛋白基因誘餌載體pGBKT7-Csd 2.4 μL和空白捕獲載體pGADT7 1.2 μL，混勻后30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，然后每管加入70 μL二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)混勻，42 ℃熱激15 min后迅速冰浴5 min，再12 000 r/min離心10 s，棄上清后每管加100 μL 1×TE重懸，涂布于SD二缺固體培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu(SD瓊脂無機鹽46.7 g/L、-Leu/-Trp DO Supplement 0.64 g/L，pH 5.8)，30 ℃倒置培養(yǎng)3～7 d。挑取5個正常生長的單菌落，接種于1 mL SD二缺液體培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu(SD無機鹽26.7 g/L、-Leu/-Trp DO Supplement 0.64 g/L，pH 5.8)，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.8～1.2。取6 μL培養(yǎng)液，涂布于加有半乳糖苷酶顯色底物X-α-Gal的SD四缺固體培養(yǎng)基SD/-Ade-His-Trp-Leu/X-α-Gal(SD瓊脂培養(yǎng)基46.7 g/L、-Ade/-His/-Leu/-Trp DO Supplement 0.60 g/L、X-α-Gal 5 mg/L，pH 5.8)，以轉(zhuǎn)化pGBKT7-53和pGBKT7-Lam(豐輝生物，長沙)的酵母菌株分別為陽性和陰性對照，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察拍照并記錄酵母菌斑生長及變藍(lán)情況，分析候選底物蛋白是否存在自體磷酸化現(xiàn)象。

1.6 酵母雙雜交

在離心管中各加入100 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞和600 μL PEG4000 LiAc溶液，然后分別加入捕獲載體pGADT7-ZmSnRK2和候選底物蛋白編碼基因誘餌載體pGBKT7-Csd各2.4 μL，重復(fù)3次，混勻后30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min。按自體磷酸化檢測的方法熱激轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞并經(jīng)二缺培養(yǎng)基篩選后，轉(zhuǎn)接四缺培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察記錄菌斑生長及變藍(lán)情況，分析各ZmSnRK2家族成員與候選底物蛋白之間是否存在相互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)ABA誘導(dǎo)的ZmSnRK2候選底物蛋白的篩選結(jié)果

以玉米中響應(yīng)ABA誘導(dǎo)且磷酸化水平上調(diào)的238個蛋白質(zhì)的氨基酸序列為探針，與擬南芥已知SnRK2底物蛋白的氨基酸序列進行本地Blastp比對，篩選出47個同源蛋白，注釋功能涉及蛋白質(zhì)可逆磷酸化、轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控、能量代謝、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移、跨膜運輸?shù)缺姸嗌砩^程(表3)。用Motif-X軟件，從238個響應(yīng)ABA誘導(dǎo)且磷酸化水平上調(diào)的蛋白中，篩選出23個包含保守基序-RXXS-的蛋白(表4)。同時滿足這兩項條件的蛋白有XP_008666965.1、NP_001183680.1、XP_008662247.1、NP_001167942.1、XP_008656995.1、NP_001152904.1、NP_001145831.1、NP_001149268.1、NP_001132279.1和NP_001142137.1共10個，其為預(yù)測的響應(yīng)ABA誘導(dǎo)的ZmSnRK2候選底物蛋白。

表3 與擬南芥已知SnRK2底物同源的玉米蛋白Table 3 Maize proteins homologous to identified substrate proteins of SnRK2 in Arabidopsis

表3(續(xù)) Continued table 3

表4 含保守基序-RXXS-的玉米蛋白Table 4 Maize proteins containing conserved phosphorylation motif -RXXS- of SnRK2

表4(續(xù)) Continued table 4

2.2 ZmSnRK2基因家族ORF的擴增結(jié)果

以玉米總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用表1所列引物進行PCR擴增，得到ZmSnRK2基因家族11個生物信息學(xué)全基因組預(yù)測成員中的10個編碼序列(圖1)，測序結(jié)果表明，擴增到的序列完全正確，與Huai等[29]的定量PCR擴增結(jié)果一致；未得到ZmSnRK2.9的條帶，因此認(rèn)為ZmSnRK2.9可能是喪失表達(dá)能力的假基因。這10個ZmSnRK2基因家族包含ZmSnRK2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.10、2.11，其相關(guān)信息見表5。

M.DL2000 DNA Marker;1～10.分別為ZmSnRK2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.10、2.11基因的ORFM.DL2000 DNA marker;1-10.The ORFs of ZmSnRK2.1，2.2,2.3,2.4,2.5,2.6,2.7,2.8,2.10,and 2.11,respectively圖1 玉米ZmSnRK2基因ORF的PCR擴增Fig.1 PCR amplification of ZmSnRK2 genes ORF of maize

2.3 編碼ZmSnRK2候選底物蛋白基因的ORF擴增結(jié)果

以玉米總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用表2所列引物進行PCR擴增，得到8個編碼ZmSnRK2候選底物蛋白基因的ORF(圖2)。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，編碼序列號為NP_001145831.1的蛋白基因ORF序列第63堿基由C突變?yōu)門，致使第21個密碼子由UGG同義突變?yōu)閁GA，但仍編碼甘氨酸。其余7個基因的ORF序列擴增結(jié)果完全正確(表6)。未擴增出編碼基因的2個候選底物蛋白(XP_008662247.1和NP_001152904.1)均為功能未知的推導(dǎo)蛋白(表4)。

M1～M3.分別代表DL500，DL1000及DL2000 DNA Marker;1～8.分別為GenBank序列號為XP_008666965.1、XP_008656995.1、NP_001132279.1、NP_001183680.1、NP_001145831.1、NP_001149268.1、NP_001167942.1和NP_001142137.1蛋白的編碼ORFM1-M3.Represent DL500，DL1000 and DL2000 DNA Marker,respectively;1-8.Indicate XP_008666965.1，XP_008656995.1，NP_001132279.1，NP_001183680.1，NP_001145831.1，NP_001149268.1，NP_001167942.1 and NP_001142137.1 proteins coding ORF

表6 玉米ZmSnRK2候選底物蛋白基因信息Table 6 Information of encoding genes of candidate ZmSnRK2 substrate proteins of maize

2.4 ZmSnRK2候選底物蛋白的自體磷酸化檢測

圖3結(jié)果表明，8個ZmSnRK2候選底物蛋白編碼基因轉(zhuǎn)化的酵母在二缺培養(yǎng)基(SD/-Trp-Leu)上均能長出菌落，說明全部轉(zhuǎn)化成功。在添加半乳糖苷酶顯色底物X-α-Gal的SD四缺培養(yǎng)基SD/-Ade-His-Trp-Leu上，轉(zhuǎn)化編碼序列號為XP_008666965.1、NP_001142137.1和XP_008656995.1的3個候選底物蛋白基因的酵母菌株，與陽性對照(pGBKT7-53)一樣顯現(xiàn)藍(lán)色菌落，說明有自磷酸化現(xiàn)象發(fā)生，不能用Y2H檢測其與ZmSnRK2的相互作用；轉(zhuǎn)化編碼其余5個預(yù)測底物蛋白基因的酵母菌株，與陰性對照(pGBKT7-Lam)一樣未顯現(xiàn)藍(lán)色菌落，說明無自體磷酸化，可用Y2H檢測其與ZmSnRK2的相互作用。

1～10.分別代表pGBKT7-NP_001149268.1、-NP_001132279.1、-NP_008666965.1、-NP_001142137.1、-NP_001167942.1、-NP_001183680.1、-NP_001145831.1、-XP_008656995.1、pGBKT7-53陽性對照及pGBKT7-Lam陰性對照載體1-10.represent pGBKT7-NP_001149268.1,-NP_001132279.1,-NP_008666965.1,-NP_001142137.1,-NP_001167942.1,-NP_001183680.1,-NP_001145831.1,-XP_008656995.1,pGBKT7-53 (Positive CK) and pGBKT7-Lam(Negative CK) vectors,respectively

2.5 ZmSnRK2與候選底物蛋白的相互作用

分別將8個ZmSnRK2基因捕獲載體pGADT7-ZmSnRK2.1、2.2、2.4、2.5、2.7、2.8、2.10、2.11與5個編碼無自體磷酸化的候選底物蛋白基因誘餌載體pGBKT7-Csd轉(zhuǎn)化酵母，3次重復(fù)，共120個轉(zhuǎn)化處理，結(jié)果酵母菌均可在二缺培養(yǎng)基SD/-Trp-Leu上生長，說明全部轉(zhuǎn)化成功。如圖4所示，在添加半乳糖苷酶顯色底物X-α-Gal的四缺培養(yǎng)基SD/-Ade-His-Trp-Leu上，編碼序列號為NP_001149268.1和NP_001132279.1的2個蛋白基因的誘餌載體pGBKT7-Csd與8個捕獲載體共轉(zhuǎn)化的酵母菌株均未顯現(xiàn)藍(lán)色菌落，說明這16個蛋白質(zhì)組合之間無相互作用。編碼序列號為NP_001183680.1蛋白基因的誘餌載體pGBKT7-Csd與8個捕獲載體共轉(zhuǎn)化的酵母菌株均顯現(xiàn)藍(lán)斑菌落，說明這8個蛋白質(zhì)組合之間存在相互作用。編碼序列號為NP_001145831.1的蛋白基因的誘餌載體pGBKT7-Csd與捕獲載體pGADT7-ZmSnRK2.1共轉(zhuǎn)化的酵母菌株及編碼序列號為NP_001167942.1的蛋白基因的誘餌載體pGBKT7-Csd與捕獲載體pGADT7-ZmSnRK2.10共轉(zhuǎn)化的酵母菌株均顯現(xiàn)藍(lán)色菌落，說明這2個蛋白質(zhì)組合之間存在相互作用。

3 討 論

Y2H結(jié)果證實，序列號為NP_001183680.1和NP_001167942.1的候選底物蛋白可與ZmSnRK2家族的成員相互作用，而這2個蛋白的磷酸化水平受ABA誘導(dǎo)而上調(diào)[32]，說明其可能是ZmSnRK2家族成員磷酸化的底物。其中，序列號為NP_001183680.1的蛋白在玉米中的功能未知，但其在擬南芥中的同源蛋白(AT1G69220)功能為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。序列號為NP_001167942.1的蛋白屬于包含SAM(Sterile alpha motif)結(jié)構(gòu)域的一類蛋白，涉及眾多生理生化過程[33-36]。由此說明，在ZmSnRK2的下游ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)呈發(fā)散狀，有待進一步深入研究。

1～3.分別為每個ZmSnRK2與其候選底物蛋白進行酵母雙雜交的3次重復(fù)1-3.Represent three repetitions of yeast two-hybrid between ZmSnRK2 and their candidate substrate proteins