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      組蛋白脫乙酰酶抑制劑丁酸鈉對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖與凋亡的影響

      2018-10-26 02:09:34羅娟南祖峰羅玲張風(fēng)莉
      癌癥進(jìn)展 2018年10期
      關(guān)鍵詞:明顯降低乙酰化細(xì)胞周期

      羅娟,南祖峰,羅玲,張風(fēng)莉

      1解放軍第十五醫(yī)院婦產(chǎn)科,新疆 烏蘇 833000

      2解放軍69230部隊(duì)醫(yī)院門診,新疆 烏蘇 833000

      3新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)七師125團(tuán)醫(yī)院內(nèi)科,新疆 奎屯 833203

      4新疆軍區(qū)總醫(yī)院病理科,烏魯木齊 830000

      宮頸癌是一種常見的婦科惡性腫瘤。近年來,隨著宮頸細(xì)胞學(xué)篩查技術(shù)的不斷提高,宮頸癌的發(fā)病率及病死率雖然有所降低,但是發(fā)病年齡卻呈年輕化趨勢[1-3]。與其他腫瘤組織相似,宮頸癌組織呈現(xiàn)較低的組蛋白乙?;剑M蛋白的乙?;饕山M蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)與組蛋白乙?;D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase,HAT)調(diào)控,因此組蛋白脫乙酰酶抑制劑(histone deacetylase inhibitor,HDACi)成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4-6]。HDACi包括短鏈脂肪酸類、氧肟酸類、環(huán)形四肽類、苯酸胺類4大類。其中丁酸鈉屬于短鏈脂肪酸,具有高效、低毒等特點(diǎn),不影響正常細(xì)胞的活性,因此被逐漸用于腫瘤細(xì)胞的治療中[4-6]。相關(guān)研究顯示,丁酸鈉對宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用[7],但其具體的作用機(jī)制尚未明確。因此,本研究將探討丁酸鈉對HeLa細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制,旨在為丁酸鈉用于宮頸癌的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 細(xì)胞株

      宮頸癌HeLa細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫,于含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

      1.2 試劑與儀器

      DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司;兔抗人B淋巴細(xì)胞瘤因子-2(bcl-2)、bcl-2相關(guān)X蛋白(BAX)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)、p27、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗體均購自美國Abcam公司;Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自南通碧云天生物技術(shù)有限公司;ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)購自美國伯樂公司;FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司;MK3酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司。

      1.3 噻唑藍(lán)(MTT)法檢測HeLa細(xì)胞活力

      取5×103個處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種至6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,加入200 μl終濃度為0、2.5、5.0、10.0 mmol/L的丁酸鈉作用細(xì)胞24、48、72 h,加入MTT孵育4 h后,小心吸取上清液棄掉后加入150 μl的二甲基亞砜,振蕩使結(jié)晶物溶解,在570 nm波長處測定光密度(optical delnsity,OD)值,OD570nm值即代表細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

      1.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡

      取9×103個處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種至6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,加入1 ml終濃度為0、2.5、5.0、10.0 mmol/L的丁酸鈉作用細(xì)胞48 h,收集1×105/ml細(xì)胞,加入結(jié)合緩沖液混勻后,繼續(xù)加入Annexin V-FITC及PI并混勻,1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測并分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

      1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

      將9×103個處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種至6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,加入1 ml終濃度為0、2.5、5.0、10.0 mmol/L的丁酸鈉作用細(xì)胞48 h,收集1×105/ml細(xì)胞,加入RNase混勻并孵育1 h,再加入PI染液孵育30 min,1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測并分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

      1.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá)

      取9×103個處于對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞接種至6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,加入1 ml終濃度為0、2.5、5.0、10.0 mmol/L的丁酸鈉作用細(xì)胞48 h,收集細(xì)胞并裂解得到細(xì)胞總蛋白,測定蛋白濃度。制作濃縮膠和分離膠,蛋白上樣后,進(jìn)行凝膠電泳,濕法轉(zhuǎn)PVDF膜,脫脂奶粉封閉1 h后,一抗4℃過夜孵育,二抗室溫孵育1 h,于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算bcl-2、BAX、cyclin D1、p27、PI3K蛋白的相對表達(dá)量;以AKT為內(nèi)參,計(jì)算p-AKT蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

      1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

      采用SPSS 17.0-軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間比較采用F檢驗(yàn),多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 丁酸鈉對HeLa細(xì)胞活力的影響

      MTT法檢測結(jié)果顯示:與0 mmol/L丁酸鈉比較,2.5、5.0、10.0 mmol/L丁酸鈉分別作用24、48、72 h后HeLa細(xì)胞的細(xì)胞活力均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);不同濃度丁酸鈉作用HeLa細(xì)胞48、72 h時的細(xì)胞活力比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),因此本研究后續(xù)選擇48 h作為作用時間。(表1)

      表1 不-同濃度丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞的細(xì)胞活力比較(±s)

      表1 不-同濃度丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞的細(xì)胞活力比較(±s)

      注:*與0 mmol/L的丁酸鈉比較,P<0.01

      丁酸鈉濃度(mmol/L)24 h48 h72 h 0 0.48±0.040.59±0.060.68±0.06 2.50.43±0.04*0.45±0.05*0.43±0.04*5.00.40±0.04*0.38±0.04*0.37±0.03*10.00.38±0.03*0.33±0.03*0.33±0.03*

      2.2 丁酸鈉對HeLa細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

      采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度丁酸鈉作用48 h后HeLa細(xì)胞的凋亡及細(xì)胞周期情況,結(jié)果顯示:與0 mmol/L丁酸鈉比較,2.5、5.0、10.0 mmol/L丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均明顯增高,G1期細(xì)胞所占比例均明顯增高,S期和G2期細(xì)胞所占比例均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(表2)

      2.3 丁酸鈉對HeLa細(xì)胞中BAX、bcl-2、cyclin D1及p27蛋白表達(dá)的影響

      Western blot檢測結(jié)果顯示:與0 mmol/L丁酸鈉比較,2.5、5.0、10.0 mmol/L丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞中cyclin D1蛋白的相對表達(dá)量均明顯降低,BAX、p27蛋白的相對表達(dá)量均明顯增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與0 mmol/L丁酸鈉比較,5.0、10.0 mmol/L丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞中bcl-2蛋白的相對表達(dá)量均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(表3)

      表2 不同濃度丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞的凋亡情況及細(xì)胞周期的比較(%,±s)

      表2 不同濃度丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞的凋亡情況及細(xì)胞周期的比較(%,±s)

      注:*與0 mmol/L丁酸鈉比較,P<0.01

      細(xì)胞周期細(xì)胞凋亡早期凋亡2.31±0.24 7.48±0.75*12.51±1.25*18.38±1.84*晚期凋亡3.55±0.35 8.92±0.89*14.87±1.49*22.29±2.23*G1期45.49±4.49 51.28±5.13*57.29±5.73*64.56±6.45*S期31.28±3.30 28.36±2.84*24.67±2.47*20.59±2.06*G2期23.23±2.32 20.36±2.04*18.04±1.80*14.85±1.49*丁酸鈉濃度(mmol/L)0 2.5 5.0 10.0

      表3 不同濃度丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞中BAX-、bcl-2、cyclin D1、p27蛋白相對表達(dá)量的比較(±s)

      注:*與0 mmol/L丁酸鈉比較,P<0.01

      丁酸鈉濃度(mmol/L)0 2.5 5.0 10.0 0.58±0.02 0.55±0.02 0.23±0.04*0.10±0.11*0.13±0.01 0.28±0.03*0.72±0.08*1.18±0.12*0.73±0.07 0.42±0.04*0.34±0.03*0.15±0.01*0.13±0.01 0.26±0.02*0.38±0.03*0.40±0.04*bcl-2BAX cyclin D1p27

      2.4 丁酸鈉對HeLa細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

      Western blot檢測結(jié)果顯示:與0 mmol/L丁酸鈉比較,2.5、5.0、10.0 mmol/L丁酸鈉作用后HeLa細(xì)胞中PI3K、p-AKT蛋白的相對表達(dá)量均明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。(表4)

      表4 不同濃度丁酸鈉處理后HeLa細(xì)胞中-PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的比較(±s)

      表4 不同濃度丁酸鈉處理后HeLa細(xì)胞中-PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白相對表達(dá)量的比較(±s)

      注:*與0 mmol/L丁酸鈉比較,P<0.01

      PI3K 0.97±0.09 0.51±0.04*0.35±0.03*0.23±0.02*1.08±0.09 0.83±0.08*0.43±0.04*0.25±0.03*0 2.5 5.0 10.0 p-AKT丁酸鈉濃度(mmol/L)

      3 討論

      組蛋白的乙?;街饕蒆DAC與HAT共同調(diào)控,二者的失衡,激活下游基因的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生,使腫瘤組織呈現(xiàn)低的乙?;絒4-6]。HDACi是目前公認(rèn)的一類高效、低毒、光譜的抗腫瘤新型藥物,能夠提高染色質(zhì)組蛋白乙?;?,促使腫瘤細(xì)胞分化或凋亡[4-6]。丁酸鈉作為一種HDACi,是食物纖維在結(jié)腸內(nèi)發(fā)酵得到的一種小分子化合物,能夠誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的分化、凋亡,并使腫瘤細(xì)胞生長阻滯[7-10]。目前,關(guān)于丁酸鈉對宮頸癌細(xì)胞誘導(dǎo)作用的報(bào)道相對較少,因此本研究將對此進(jìn)行闡述。

      陳萍等[10]研究結(jié)果顯示,丁酸鈉作用于人食管癌KYSE-150細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)值為5.6 mmo/L。羅曉華等[7]研究表明,1、2、4、8 mmol/L丁酸鈉作用后,能明顯降低HeLa細(xì)胞的活力。本研究MTT法檢測結(jié)果顯示,與0 mmol/L丁酸鈉比較,2.5、5.0、10.0 mmol/L丁酸鈉作用HeLa細(xì)胞24、48、72 h后,細(xì)胞活力均明顯降低(P<0.01),但丁酸鈉處理48 h及72 h時,對HeLa細(xì)胞的作用強(qiáng)度一致,因此本研究后續(xù)選擇48 h作為作用時間,且本研究的丁酸鈉濃度范圍與羅曉華等[7]和陳萍等[10]一致,說明在此劑量濃度范圍內(nèi)丁酸鈉能明顯降低HeLa細(xì)胞活力,后續(xù)的Annexin V-FITC/PI流式雙染實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),丁酸鈉能明顯誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。細(xì)胞的凋亡受細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白調(diào)控,bcl-2家族中的抑凋亡蛋白bcl-2與促凋亡蛋白BAX結(jié)合,可以阻斷上游凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)細(xì)胞存活與生長。而促凋亡蛋白BAX自身還能夠形成二聚體,傳遞上游凋亡信號,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步探討丁酸鈉對HeLa細(xì)胞中bcl-2及BAX蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果表明丁酸鈉能明顯上調(diào)BAX蛋白表達(dá),下調(diào)bcl-2蛋白表達(dá),最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡密不可分,細(xì)胞周期調(diào)控點(diǎn)是細(xì)胞增殖與凋亡的雙向開關(guān)。G1/S期是真核細(xì)胞周期重要的檢測點(diǎn),當(dāng)此調(diào)控點(diǎn)缺陷時,DNA修復(fù)停止,細(xì)胞無法凋亡,同時cyclin D與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物,促使Rb磷酸化,進(jìn)一步誘導(dǎo)E2F3進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)增殖相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄,而細(xì)胞周期蛋白抑制子p27無法阻擋細(xì)胞周期蛋白與CDK的結(jié)合,最終促使腫瘤細(xì)胞不斷復(fù)制并惡性化[11-12]。相關(guān)研究顯示,丁酸鈉能夠通過上調(diào)p21表達(dá)并下調(diào)CDK7表達(dá),促使HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G1期[7]。本研究結(jié)果顯示,丁酸鈉能夠通過上調(diào)p27表達(dá),下調(diào)cyclin D1表達(dá),使細(xì)胞周期阻滯于G1期,說明丁酸鈉能夠通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)使HeLa細(xì)胞周期發(fā)生阻滯。

      宮頸癌細(xì)胞的增殖、凋亡及細(xì)胞周期與眾多信號通路密切相關(guān),PI3K/AKT信號通路便是其中一種。該信號通路在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中被高度激活,PI3K被激活后,將下游底物二磷酸磷脂酰肌醇的3’羥基磷酸化并使之變成三磷酸磷脂酰肌醇,進(jìn)而使AKT的絲氨酸-蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化,活化后的AKT進(jìn)入細(xì)胞核,調(diào)控靶蛋白(bcl-2、cyclin D1、MMP等)的表達(dá),最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲等[13-14]。相關(guān)研究顯示,丁酸鈉能夠通過PI3K/AKT信號通路抑制缺血再灌注引起的小鼠神經(jīng)元凋亡,提示丁酸鈉對PI3K/AKT信號通路具有調(diào)控作用[15]。本研究繼續(xù)探討丁酸鈉對HeLa細(xì)胞中PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果表明丁酸鈉能明顯下調(diào)PI3K及p-AKT的表達(dá)。

      綜上所述,2.5、5.0、10.0 mmol/L的丁酸鈉均能明顯降低HeLa細(xì)胞活力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,使細(xì)胞周期阻滯于G1期,下調(diào)bcl-2、cyclin D1蛋白表達(dá),上調(diào)BAX及p27蛋白表達(dá),此過程可能是通過阻斷PI3K/AKT信號通路實(shí)現(xiàn)的。

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