張詩嘉 黃云 盛安琪 劉文濤 張廣欽

神經病理性疼痛(neuropathic pain)是臨床常見的疾病,嚴重影響人們的身體健康, 國際疼痛研究協(xié)會把其定義為由軀體感覺神經系統(tǒng)的損傷或疾病而直接造成的疼痛。外周感覺神經通過DRG上的細胞體通過感覺神經元通路與中樞神經相連。因此, DRG神經在感覺刺激如疼痛傳遞到中樞神經系統(tǒng)過程在起著關鍵作用［1］。雖然多種因素都可導致神經病理性疼痛, 其發(fā)病機制并不十分清楚, 但鈉通道被認為在疼痛中發(fā)揮著重要作用［2］。電壓門控鈉通道(VGSCs)分為河豚毒素敏感型(TTX-S)和TTX-R兩種類型, 主要調控外周軸突損傷和炎癥誘導的神經元異常興奮。實驗研究發(fā)現(xiàn), 在小的DRG細胞主要表達TTX-R鈉通道, 而在大的DRG細胞上主要表達TTX-S鈉通道［3,4］。厚樸作為傳統(tǒng)中藥, 臨床可用于多種疾病。Hon作為厚樸中提取的一種主要活性成分, 也發(fā)揮多種生理活性和藥理作用［5,6］。近年有研究報道, Hon可以有效緩解福爾馬林誘導的炎癥疼痛, 且不會產生運動和認知方面的副作用［7］。此外, Hon明顯降低谷氨酸受體激動劑引起小鼠熱痛過敏和舔爪反應［8］。這些結果揭示了Hon在治療炎癥疼痛方面的治療潛力, 但對神經病理性疼痛的研究未見報道。本研究在CCI病理性疼痛模型上, 觀察Hon對TTX-R鈉通道的影響, 從而探討Hon可能的鎮(zhèn)痛機制, 為探索Hon臨床應用提供理論依據, 報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 昆明種小鼠, 雌雄不限, 體重18～22 g(南京青龍山動物中心提供, 實驗動物生產許可證號：SYXK(蘇)2017-0001)。

1.2 儀器 膜片鉗放大器(EPC-10, HEKA, Germany)；微電極拉制儀(P-97, Sutter, USA)；微電極拋光儀(MF-900, Micro Forge)。

1.3 試劑和溶液的配制 臺式液(mM)：NaCl 137, CaCl21,MgSO4·6H2O 1.2, KCl 5.4, NaH2PO40.33, HEPES 10, 葡萄糖10, 用 NaOH 調 pH 至 7.4。電極內液 (mM)：CsCl 140, MgSO4·6H2O2, HEPES 10, EGTA 5, ATP-Na2·3H2O 2, CaCl22, 用CsOH調pH至7.2。細胞外液(mM)：NaCl 137, MgSO4·6H2O 1.2, KCl 5.4, NaH2PO40.33, HEPES 10, 葡萄糖 10, CaCl21,Nifedipine 0.005, 用NaOH 調pH至7.4。Hon溶液的配制：藥物用于DMSO中配成10 mM母液, 使用時稀釋所需濃度。

1.4 方法

1.4.1 CCI模型制備 有文獻報道［9］, 小鼠予4%水合氯醛(0.3 ml/10 g)腹腔麻醉, 分離左側坐骨神經, 用5-0羊腸線松弛結扎形成壓迫, 結扎共四道, 間隔1 mm, 共約5 mm, 使神經外膜輕度凹陷, 但不阻斷血供, 縫合皮膚。

1.4.2 機械學痛閾測定(Von Frey Hairs法) 在安靜狀態(tài)下,室溫保持23～25℃, 將小鼠置于透明的網格籠中, 以纖維絲尖部刺激小鼠足底, 從小逐漸增壓至小鼠縮足, 每次測量間隔3 min, 此最大壓力即為機械性刺激縮足反射閾值。術后每天測定, 7 d后基礎閾值下降＞40% , 即為造模成功。

1.4.3 DRG細胞分離 參考文獻［10］, 小鼠麻醉, 分離脊椎放入冷的臺式液中, 分別從L4～6椎間孔中分離出DRG, 修剪后放入含膠原酶Ⅱ1 mg/ml臺式液中37℃消化 1 h, 然后反復吹打, 臺式液沖洗3遍, 過濾, 分離的單個細胞保存臺式液中。

1.4.4 膜片鉗記錄 細胞加入裝有細胞外液的細胞皿中,待細胞貼壁后, 使玻璃微電極與細胞形成高阻封接(＞1 MΩ),破膜形成全細胞模式。應用膜片鉗放大器記錄鈉電流。拉制的玻璃微電極充滿電極內液后阻抗為3～5 MΩ, 數據低通濾波3 kHz, 采樣10 Hz, 串聯(lián)電阻補償(＞70%), Pulse軟件完成對刺激參數的控制和數據的采集。實驗溫度保持在23～25℃。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行數據統(tǒng)計分析。計量資料以均數±標準差()表示, 采用t檢驗；計數資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CCI小鼠機械痛閾值的變化 用測痛包測量小鼠機械痛閾值。CCI手術后從第5天開始, 小鼠機械痛閾值明顯下降, 10 d后逐漸達到穩(wěn)定, 14 d后, 疼痛閾值從(1.1±0.1)g下降到(0.4±0.1)g, 下降62.0 %, 表明CCI模型成功。見圖1。

圖1 CCI模型機械痛閾值的變化

2.2 Hon對CCI小鼠DRG TTX-R鈉電流的影響 為了記錄TTX-R鈉電流, 實驗選用＜30 m DRG細胞, 0.5 M TTX加入細胞外液阻斷TTX-S鈉電流。鉗制電壓保持在70 mV, 細胞從50 mV開始去極化至70 mV, 每次增加5 mV, 脈沖持續(xù)200 ms,激活TTX-R鈉電流。在正常DRG細胞上, 觀察了Hon 的量效曲線。Hon 1100 M濃度范圍內濃度依賴性抑制TTX-R鈉電流, IC50 為28.1 M。在圖2中應用30 M Hon。

圖2 正常組、CCI組和CCI給予30 M Hon后TTX-R鈉電流原始圖

在CCI模型上TTX-R鈉電流明顯增加, Hon 30 μM能較好的阻斷TTX-R鈉電流。電流-電壓(I-V)關系顯示見圖3,與正常組比較, CCI模型組使TTX-R鈉電流的最大激活電壓從正常組5 mV左移至5 mV, 最大激活電流密度由(45.3±5.1) pA/pF增加至(57.7±5.9) pA/pF(P＜0.05, n=10), 反轉電位大約從+70.9 mV左移至+47.3 mV(P＜0.05)。應用Hon后, 使CCI小鼠TTX-R鈉電流最大激活電壓恢復至0 mV, 最大激活電流密度減小到(27.9±4.9) pA/pF(與CCI組比較, P＜0.05,n=10), 反轉電位左移至+43.1 mV(與CCI組比較, P＞0.05)。

圖3 Hon 對CCI小鼠DRG TTX-R鈉電流I-V關系的影響

2.3 Hon對CCI小鼠DRG TTX-R鈉電流激活曲線的影響 穩(wěn)態(tài)激活曲線從I-V曲線數據獲得。鈉電流激活曲線用Boltzmann 方程擬合: G/Gmax = 1/{1+exp［(V1/2-V)/k］}, G是電導, Gmax是最大電導, V是測試電壓, V1/2是半激活電壓,k是斜率因子。G=I/(V-Vrev), I是鈉電流, Vrev為反轉電位。正常組TTX-R鈉電流激活曲線的V1/2為(12.1±0.7) mV,k為(5.8±0.4)。與正常組比, CCI組使TTX-R鈉電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線明顯左移, V1/2為(16.9±2.1)mV(P＜0.05, n=10),k為(5.2±1.1)(P＞0.05)；Hon使CCI小鼠TTX-R鈉電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線明顯右移, 趨向正常方向, V1/2和k分別為(12.4±2.6) mV 和 (8.05±1.0)(P＜0.05, n=10)。見圖 4。

圖4 Hon 對CCI小鼠DRG TTX-R鈉電流激活曲線的影響

2.4 Hon對CCI小鼠DRG TTX-R鈉電流失活曲線的影響 采用雙脈沖刺激, 細胞鉗制在70 mV, 先給予200 ms, 從90 mV去極化至+20 mV, 每次增加10 mV的條件脈沖, 然后再給予一個100 ms去極化至+5 mV的測試脈沖。應用Boltzmann方程對TTX-R鈉電流失活曲線進行擬合：I/I=1/{1+exp［(V-V1/2)/k］}, 其中I和Imax分別為電流和最大電流, V為條件脈沖電壓, V1/2為半失活電壓, k為斜率因子。正常組TTX-R鈉電流的V1/2和k分別為(28.3±3.1) mV, k為(12.8±1.0)(n=9)。與正常組比, CCI組失活曲線無明顯影響, V1/2和k分別為(29.6±2.9)mV和(15.6±2.5)(均P＞0.05, n=9)。Hon能使CCI小鼠TTX-R鈉電流的失活曲線明顯左移, V1/2和k分別為(38.5±3.20) mV和(10.8±1.9)(均P＜0.05, n=8)。見圖5。

圖5 Hon 對CCI小鼠DRG TTX-R鈉電流失活曲線的影響

3 討論

實驗結果顯示, 在CCI模型小鼠DRG細胞上TTX-R鈉電流明顯增加, 這將有助于產生較大疼痛刺激的興奮性, 使疼痛幅度增加。此外, 最大激活電壓向左偏移約10 mV, 激活曲線左移約4.8 mV, 但不影響失活曲線, 這顯示疼痛興奮性在較低的電壓就可激發(fā), 更利于疼痛信號的產生和傳導。Hon能使CCI小鼠DRG細胞TTX-R鈉電流明顯減少, 從而降低刺激興奮性, 抑制疼痛幅度。Hon使最大激活電壓恢復到正常的0 mV左右, 通道的激活恢復趨向正常狀態(tài), 但失活曲線較CCI組向左偏移約4.5 mV, 使通道更易于關閉, 有利于阻止疼痛的產生和傳導。所以, Hon對CCI誘導的神經病理性疼痛有明顯的抑制作用。

神經病理性疼痛發(fā)病機制并不十分清楚, 臨床常用的非甾體類鎮(zhèn)痛藥物治療效果較差, 副作用較多。鈉通道作為治療疼痛的一個新靶點近來越來越受到重視［2,11］。在DRG神經細胞上, TTX-R鈉通道主要包括Nav1.8和Nav1.9, Nav1.8在角叉菜膠誘導的炎癥疼痛模型上其mRNA表達和電流均增加, 這將引起炎癥性痛覺過敏［12］。選擇性阻斷Nav1.8可緩解慢性炎癥疼痛和神經病理性疼痛［13］。Nav1.9在疼痛中的作用較復雜, 在大鼠炎癥模型上, DRG神經元Nav1.9表達顯著上升［14］。敲除Nav1.9將導致炎癥痛機制的改變［15,16］。目前認為Nav1.9參與炎癥痛［17］, 對神經病理性疼痛有待進一步研究。本實驗顯示Hon對TTX-R鈉電流有抑制作用,是否對兩種亞型具有選擇性有待下一步探討。

一些傳統(tǒng)的鈉通道阻斷劑如局部麻醉藥、抗心律失常藥等都顯示了較好疼痛作用。因此開發(fā)具備鎮(zhèn)痛作用的作用強,副作用少, 選擇性強的鈉通道阻斷劑顯示出較好的前景。由于Hon具有免疫調節(jié)作用, 因此, 其對炎性疼痛的鎮(zhèn)痛效果可能與這有關。近來報道, Hon具有明顯的鎮(zhèn)痛作用［7,8］, 其能夠抑制谷氨酸, P物質和PGE2誘導的疼痛反應, 但對神經病理性疼痛作用仍需深入研究。本實驗首次發(fā)現(xiàn)Hon在CCI模型上對TTX-R鈉電流有明顯抑制作用, 這為開發(fā)Hon作為治療鎮(zhèn)痛新藥尤其治療神經病理性疼痛的藥物提供了可靠的理論依據。