果酒酵母菌混合發(fā)酵的研究進(jìn)展

張文文，白夢(mèng)洋，吳祖芳*，翁佩芳，苗英杰

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211）

傳統(tǒng)果酒發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的多種微生物共同作用的過程，酵母在其中起著重要的作用，其中釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）主要進(jìn)行乙醇發(fā)酵，發(fā)酵速度快、發(fā)酵力強(qiáng)，而非釀酒酵母（non-Saccharomyces）能將原料中的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為風(fēng)味物質(zhì)，如酯、酸、高級(jí)醇等產(chǎn)物，并合成多種酶，對(duì)果酒的色澤、風(fēng)味的形成具有重要的作用[1-2]。與單獨(dú)發(fā)酵相比，酵母的混菌發(fā)酵能表現(xiàn)出更好的特性，如酒中甘油含量增加及乙酸含量降低，以及產(chǎn)生酯類、揮發(fā)性酚類等特殊風(fēng)味物質(zhì)，能夠改善成品酒整體質(zhì)量和品質(zhì)，增強(qiáng)果酒風(fēng)味多樣性[3-5]。

本文對(duì)果酒發(fā)酵酵母菌的種類和功能進(jìn)行了概述，著重論述了國(guó)內(nèi)外有關(guān)環(huán)境脅迫對(duì)酵母菌混合發(fā)酵的影響及混菌發(fā)酵時(shí)酵母菌之間相互作用的研究進(jìn)展，旨在為酵母菌混合發(fā)酵果酒提供理論依據(jù)。

1 果酒酵母菌

1.1 果酒生產(chǎn)相關(guān)酵母菌的種類

果酒發(fā)酵過程中有很多微生物參與其中，這些微生物中起主要作用的是酵母菌。果酒酵母菌的篩選多來自成熟果實(shí)的表皮、自然腐爛發(fā)酵的果肉、果汁以及果園的土壤[6]。

目前，人們?cè)诠麑?shí)漿果和發(fā)酵醪中共篩選出18 個(gè)屬的酵母菌，它們都能參與果酒發(fā)酵，分別是酵母屬（Saccharomyces）、類酵母屬（Saccharomycodes）、畢赤酵母屬（Pichia）、漢遜酵母屬（Hansenual）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、假絲酵母屬（Candida）、紅酵母屬（Rhodotorula）、酒香酵母屬（Brettanomyces）、德克酵母屬（Dekkera）、梅氏酵母屬（Metschnikowia）、克勒克酵母屬（Kloeckera）、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）、隱球酵母屬（Cryptococcus）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、擬威爾酵母屬（Williopsis）[7-8]。其中，畢赤酵母屬、有孢漢遜酵母屬、接合囊酵母屬、假絲酵母屬、耶氏酵母屬等非釀酒酵母與釀酒酵母菌最大的區(qū)別是能產(chǎn)生多種胞外水解酶如蛋白酶、果膠酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，這些酶有助于酒的澄清、色素的浸提以及芳香化合物的釋放[9]。而葡萄和釀酒葡萄汁中的非釀酒酵母主要是細(xì)尖酵母[10]，這些酵母通常有中等發(fā)酵能力，同時(shí)還能產(chǎn)生揮發(fā)性芳香物質(zhì)，這些非釀酒酵母有檸檬形克勒克酵母（K. apiculata）/葡萄汁有孢漢遜酵母（H. uvarum）、埃皮斯克勒克酵母（K. apis）/季也蒙有孢漢遜酵母（H. guillermondii）、非洲克勒克酵母（K. africana）/葡萄酒有孢漢生酵母（H. vineae）、皮質(zhì)克勒克酵母（K. corticis）/嗜高壓有孢漢生酵母（H.osmophila）和日本克勒克酵母（K. javanica）/罕見有孢漢遜酵母（H. occidentalis）[11]。

WL（Wallerstein laboratory nutrient agar）培養(yǎng)基鑒定法是一種新興的、較快的鑒定方法，用于檢測(cè)果酒發(fā)酵過程中的微生物種群，其現(xiàn)有的酵母菌鑒定表中含有13 類酵母菌的鑒定指標(biāo)（表1）。

目前，果酒釀造工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)不斷進(jìn)步，已經(jīng)從最初的葡萄汁有孢漢遜酵母單一介導(dǎo)的果酒自然發(fā)酵，漸漸發(fā)展成由釀酒酵母主導(dǎo)的發(fā)酵。在發(fā)酵過程中，人們還同時(shí)檢測(cè)到梅奇酵母、假絲酵母、戴爾有孢圓酵母、拜耳接合酵母、克魯維畢赤酵母等非釀酒酵母[13]。與非釀酒酵母菌相比，釀酒酵母菌的明顯生態(tài)優(yōu)勢(shì)主要在于發(fā)酵過程中能產(chǎn)生大量的乙醇和熱量。發(fā)酵過程中特定酵母菌的生長(zhǎng)會(huì)受到其他酵母菌的影響，而果酒發(fā)酵作為一個(gè)復(fù)雜的微生物反應(yīng)過程，其中酵母菌相互作用將共同影響果酒最終酒體的品質(zhì)[3]。

表 1 WL培養(yǎng)基上果酒相關(guān)酵母菌鑒定結(jié)果[12]Table 1 Characteristics of strains different yeast genera cultured in WL medium[12]

1.2 果酒酵母菌混合發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)

果酒發(fā)酵是一個(gè)繁雜的多種微生物共同作用的過程，酵母菌尤為重要，釀酒酵母主要完成乙醇發(fā)酵，其發(fā)酵速度快、發(fā)酵力強(qiáng)；而非釀酒酵母能將原料中的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為風(fēng)味物質(zhì)，如酯、酸和高級(jí)醇等產(chǎn)物，并合成多種酶，對(duì)果酒色澤、風(fēng)味的形成具有重要作用[2]。已發(fā)現(xiàn)的非釀酒酵母中，畢赤類酵母是主要的產(chǎn)酯酵母，限氧條件下還能進(jìn)行乙醇發(fā)酵，激活發(fā)酵途徑中的關(guān)鍵酶，還能增加乙醇、甘油、乙酸乙酯等代謝物的含量[14]。與單一菌發(fā)酵果酒相比，酵母混菌發(fā)酵能表現(xiàn)出更好的特性，如增加酒體中甘油的含量，降低乙酸的含量，產(chǎn)生酯類、揮發(fā)性酚類等特殊風(fēng)味物質(zhì)，改善成品酒整體品質(zhì)，豐富果酒產(chǎn)品風(fēng)味的多樣性[3-4]。酵母的混菌發(fā)酵還能減緩酒樣的褪色程度[15]。然而，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在混菌發(fā)酵時(shí)，酵母菌在其生長(zhǎng)過程中會(huì)受到毒性代謝物介導(dǎo)的抑制作用，釀酒酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)生除乙醇外的代謝產(chǎn)物，如中長(zhǎng)鏈脂肪酸、寡聚肽、環(huán)化高級(jí)醇等會(huì)抑制其他菌種的生長(zhǎng)[16]?；炀l(fā)酵過程菌種相互作用的影響因素較為復(fù)雜，不同酵母之間的作用也具有很大差異，對(duì)于其相互之間影響的本質(zhì)，國(guó)內(nèi)外至今沒有統(tǒng)一的定論。

2 環(huán)境脅迫對(duì)酵母混合培養(yǎng)的影響

酵母菌在生長(zhǎng)發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，環(huán)境條件往往會(huì)產(chǎn)生變化，有些條件對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝有益，有些條件則會(huì)阻礙酵母細(xì)胞的整體生長(zhǎng)。影響細(xì)胞生存或者影響其最佳生存條件而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響的環(huán)境因素，即為酵母菌的脅迫條件，而酵母菌在脅迫條件下往往還會(huì)產(chǎn)生一定的耐受性，以適應(yīng)不良環(huán)境帶來的危害[17]。有研究表明，酵母菌在發(fā)酵過程中會(huì)受到多種環(huán)境因素的影響，如高濃度糖導(dǎo)致的高滲透、pH值降低和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗等。在果酒發(fā)酵過程中，酵母細(xì)胞在接種后會(huì)面臨高糖濃度（高滲透壓）和較低的pH值（通常在4以下）脅迫。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，在酵母細(xì)胞適應(yīng)不良環(huán)境條件后，會(huì)逐漸進(jìn)入遲滯期，酵母細(xì)胞開始快速分裂，并將葡萄糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇，此時(shí)產(chǎn)生乙醇脅迫。在旺盛的發(fā)酵過程中，溫度還會(huì)不斷變化，前期不斷上升，然后大幅下降；因此要進(jìn)行控溫處理，否則還會(huì)產(chǎn)生溫度脅迫。當(dāng)酵母細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期后，呼吸功能下降會(huì)導(dǎo)致氧化脅迫，此時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變得有限或者消耗殆盡，產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)脅迫；此外，酵母細(xì)胞還可能暴露于培養(yǎng)基成分（如重金屬）和為控制微生物污染所加硫（如SO2）中[18]。

2.1 高糖脅迫

濃醪發(fā)酵是果酒產(chǎn)業(yè)的新趨勢(shì)，采取濃醪發(fā)酵生產(chǎn)果酒，能夠節(jié)約相當(dāng)用量的水，降低能源成本；同時(shí)這種發(fā)酵工藝所生成的乙醇濃度較高，醪液中的糖度也較高，能夠大幅提高產(chǎn)出，具有很好的應(yīng)用價(jià)值[19]。然而，在采用濃醪發(fā)酵過程中，尤其是在發(fā)酵初期，發(fā)酵醪的滲透壓較高，含糖量達(dá)180～260 g/L，容易引起酵母細(xì)胞內(nèi)水分活度、細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成發(fā)生變化，造成酵母細(xì)胞皺縮失水，破壞細(xì)胞膜的雙層結(jié)構(gòu)，阻礙細(xì)胞膜上的一些蛋白質(zhì)的活性和離子通道，還會(huì)使大分子聚集，改變其構(gòu)象，從而影響生物大分子的活性[20]。Park等研究了酵母菌在高滲條件下的耐受性，發(fā)現(xiàn)酵母菌本身存在對(duì)高滲透壓的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，同時(shí)還存在多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑和分子應(yīng)答機(jī)制[21]。de Kock發(fā)現(xiàn)，在高滲透壓下，釀酒酵母傾向于產(chǎn)生甘油作為滲透保護(hù)劑，即在糖酵解產(chǎn)生的磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化為甘油的過程中NADH氧化生成NAD+，而甘油的產(chǎn)生往往導(dǎo)致乙酸的增加[22]。實(shí)際上，釀酒酵母產(chǎn)生乙酸為的是減少甘油形成期間產(chǎn)生的NAD+[23]。而非釀酒酵母則相反，產(chǎn)生較低濃度的乙酸，其乙酸的產(chǎn)生與甘油不具有相關(guān)性。而當(dāng)釀酒酵母和非釀酒酵母混合發(fā)酵時(shí)，與純種發(fā)酵相比，甘油濃度更高，乙酸濃度更低[22]。目前，關(guān)于濃醪發(fā)酵條件下酵母的生態(tài)行為變化多集中在單一菌種發(fā)酵方面，實(shí)際生產(chǎn)中，往往采用釀酒酵母和非釀酒酵母混合進(jìn)行發(fā)酵，從而提高甘油和乙醇濃度，增加酒體風(fēng)味，而在高糖脅迫下進(jìn)行多菌種混合發(fā)酵，由于酵母滲透壓調(diào)節(jié)系統(tǒng)的表達(dá)方式和強(qiáng)弱程度有差異，耐滲性也各有不同，國(guó)內(nèi)外至今沒有統(tǒng)一的定論。

2.2 低pH值脅迫

在果酒發(fā)酵過程中，酵母菌還會(huì)受到低pH值造成的脅迫。維持細(xì)胞內(nèi)正常pH值對(duì)保證機(jī)體正常生理功能至關(guān)重要，例如蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定、氧化還原狀態(tài)的變化以及酶反應(yīng)的進(jìn)行等。多數(shù)酵母在pH 2.50～8.50之間能夠生長(zhǎng)，在微酸性的條件下，其最適生長(zhǎng)pH值為4.5～5.0[24]。

隨著環(huán)境中酸脅迫的進(jìn)行，培養(yǎng)液中的pH值將影響到酵母質(zhì)膜所帶的電荷，導(dǎo)致其質(zhì)膜對(duì)一些離子滲透性產(chǎn)生變化，進(jìn)而影響酵母細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)的能力、相關(guān)酶的合成及代謝通路的某些生化反應(yīng)的進(jìn)行。過高和過低的pH值都會(huì)破壞酵母蛋白，引起細(xì)胞死亡[25]。果酒釀造時(shí)所控制的pH值在3.0～3.6之間，將產(chǎn)生環(huán)境低pH值脅迫，而在乙醇發(fā)酵的后期，隨著醋酸、乳酸等有機(jī)酸的產(chǎn)生，也可能產(chǎn)生低pH值脅迫，導(dǎo)致細(xì)胞酸化，從而影響酵母菌的正常生長(zhǎng)代謝。

2.3 乙醇脅迫

隨著果酒發(fā)酵的進(jìn)行，由于乙醇的大量積累，高濃度的乙醇會(huì)嚴(yán)重影響酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。一般認(rèn)為，乙醇對(duì)酵母細(xì)胞的脅迫主要是影響其細(xì)胞形態(tài)和正常生理活動(dòng)，主要表現(xiàn)在使酵母細(xì)胞骨架變得松散，細(xì)胞變大，破壞其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，影響酵母對(duì)葡萄糖、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，使生物大分子合成和代謝受阻。此外，乙醇脅迫還會(huì)改變酵母相關(guān)酶酶活性。聶妤等研究了在不同乙醇濃度時(shí)酵母細(xì)胞的酶活力，選取三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑的關(guān)鍵代謝節(jié)點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、異檸檬酸裂解酶和蘋果酸脫氫酶對(duì)乙醇有良好的耐受性，而異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸激酶和乙醇脫氫酶對(duì)乙醇的耐受性較差[26]。

混菌發(fā)酵過程中，不同酵母菌在生長(zhǎng)過程中通過產(chǎn)生各種毒性化合物進(jìn)行多種生化反應(yīng)，或?yàn)榱烁?jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分而相互作用，其中釀酒酵母代謝產(chǎn)生乙醇來抑制其他菌群生長(zhǎng)所產(chǎn)生的影響最為深遠(yuǎn)。研究證實(shí)，由高濃度的醇類產(chǎn)生的乙醇脅迫是釀酒酵母相對(duì)非于釀酒酵母形成優(yōu)勢(shì)地位的主要因素[27]。

2.4 營(yíng)養(yǎng)脅迫

酵母菌的生長(zhǎng)需要各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在發(fā)酵初期，各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，隨著發(fā)酵的不斷進(jìn)行，氮源和碳源等營(yíng)養(yǎng)成分逐漸消耗殆盡，酵母菌缺乏必需的營(yíng)養(yǎng)素，進(jìn)入特定的非繁殖階段，生長(zhǎng)逐步停滯[28]。而在混菌發(fā)酵后期，不同酵母菌的數(shù)量有所不同，對(duì)環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)有差異，而營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏進(jìn)一步造成酵母菌之間生長(zhǎng)狀態(tài)的差異。Medina等發(fā)現(xiàn)，在混合培養(yǎng)中，非釀酒酵母的生長(zhǎng)會(huì)消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其后接種的釀酒酵母生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)匱乏，最終導(dǎo)致發(fā)酵緩慢或發(fā)酵不完全；與按順序接種非釀酒酵母和釀酒酵母相比，同時(shí)接種非釀酒酵母和釀酒酵母，果酒發(fā)酵速度更慢，在添加氮源和維生素后，釀酒酵母所占比例有顯著提高[29]。而酵母提取物[30]或20 種氨基酸混合物[31]的添加則能大幅提高非釀酒酵母非洲克勒克氏酵母的發(fā)酵效率。相比非釀酒酵母，釀酒酵母能更快速有效地利用氮源，這可能是其在工業(yè)發(fā)酵中成功應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一，尤其是以氮源為明顯限制因素的發(fā)酵液中如葡萄汁[32]。

2.5 其他脅迫

果酒發(fā)酵過程中，除了常見的高糖、高濃度乙醇、低pH值和營(yíng)養(yǎng)脅迫等之外，酵母細(xì)胞還會(huì)暴露于其他脅迫條件下，如溫度脅迫、氧化脅迫、重金屬脅迫和硫脅迫等。

不同酵母對(duì)溫度的耐受性不同，葡萄汁酵母（S. uvarum）、庫德里阿茲威酵母（S. kudriavzevii）、貝優(yōu)酵母（S. eubayanus）及奇異酵母（S. paradoxus）在低溫下表現(xiàn)出良好的發(fā)酵能力，尤其是葡萄汁酵母，在12 ℃下能代替釀酒酵母成為優(yōu)勢(shì)菌[33]。酵母菌適宜的生長(zhǎng)溫度是22～30 ℃，不采取降溫措施容易造成溫度過高，破壞生物分子間的疏水鍵和氫鍵，導(dǎo)致核酸及蛋白質(zhì)變性，還會(huì)使細(xì)胞失水皺縮，從而引起細(xì)胞死亡[34]。高溫和高濃度乙醇還可以誘導(dǎo)酵母細(xì)胞產(chǎn)生大量的活性氧，而活性氧過多聚集在細(xì)胞中，會(huì)造成蛋白質(zhì)、脂類和DNA等大分子被破壞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損失，引起酵母細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)降解，迫使細(xì)胞死亡[35]。不同酵母菌對(duì)氧氣的耐受性不同，美極梅奇酵母菌在有氧環(huán)境甚至高曝氣條件下生長(zhǎng)得更好，而當(dāng)厭氧發(fā)酵時(shí)，美極梅奇酵母菌的優(yōu)勢(shì)地位則被釀酒酵母所取代，使得乙醇含量有所增加[36]。在實(shí)際生產(chǎn)中，SO2作為主要的殺菌劑和抗氧化劑被廣泛使用，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，高濃度SO2會(huì)使發(fā)酵的延遲期延長(zhǎng)，影響某些酵母的生長(zhǎng)，從而延緩果酒的發(fā)酵啟動(dòng)[37]，這也是脅迫因素之一。SO2的添加對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)有積極作用，不影響假絲酵母最大菌群數(shù)，但對(duì)葡萄汁有孢漢遜酵母和戴爾凱氏有孢圓酵母有負(fù)面影響[38]。

3 混合培養(yǎng)條件下酵母菌相互作用的影響

多菌種果酒發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的多種微生物共同作用的過程，不同酵母菌所起的作用也各不相同。其中酵母菌的相互作用會(huì)影響各菌種的生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物的特性，對(duì)最終酒體的性狀形成也起著重要的作用。不同酵母之間的相互作用非常復(fù)雜，包括細(xì)胞間接觸抑制、致死因子和代謝物的影響（如乙醇、脂肪酸、致死蛋白、寡聚肽等），以及一些良性協(xié)同效應(yīng)，控制酸敗微生物的生長(zhǎng)等[39-40]（圖1）。

圖 1 果酒混菌發(fā)酵中酵母菌的相互作用關(guān)系Fig. 1 Yeast interactions in mixed culture fermentation of wine

3.1 酵母細(xì)胞間的接觸抑制

接觸抑制是指多種細(xì)胞一旦彼此接觸匯合，即停止移動(dòng)和生長(zhǎng)的現(xiàn)象，細(xì)胞增殖到一定程度，也就是互相挨在一起的時(shí)候，糖蛋白識(shí)別這種信息，就會(huì)使細(xì)胞停止繼續(xù)繁殖[41]。果酒發(fā)酵過程中，由于多種酵母菌共同培養(yǎng)和生長(zhǎng)，它們之間會(huì)分泌某種或多種自誘導(dǎo)劑來判斷菌群密度和周圍的環(huán)境變化情況，當(dāng)周圍的菌群數(shù)量達(dá)到一個(gè)閾值后，菌體的基因和蛋白表達(dá)會(huì)發(fā)生改變，以此來調(diào)控菌體數(shù)量的群體行為[42]。Renault等研究了混合發(fā)酵體系中戴爾凱氏有孢圓酵母和釀酒酵母的生長(zhǎng)變化，發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞之間的接觸匯合以及某些致死分子的釋放似乎造成了戴爾凱氏有孢圓酵母的早期死亡[43]。酵母菌形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變，從絲狀到菌絲體，這也是群體感應(yīng)現(xiàn)象的表現(xiàn)，因此細(xì)胞接觸后群體感應(yīng)活性分子的識(shí)別和對(duì)基因、蛋白表達(dá)方面的影響將是揭開混合發(fā)酵體系中酵母相互作用的有效途徑。Mains等研究發(fā)現(xiàn)，在混合發(fā)酵中，受另一菌種高細(xì)胞密度的影響，兩種菌種的生物量都無法達(dá)到純培養(yǎng)時(shí)的水平[44]。

3.2 混合菌培養(yǎng)代謝物對(duì)相互作用的影響

研究表明，蛋白質(zhì)代謝物的產(chǎn)生對(duì)混合發(fā)酵酵母菌的生長(zhǎng)狀態(tài)有顯著的影響，釀酒酵母會(huì)產(chǎn)生一種陽離子多肽，被鑒定為甘油醛磷酸脫氫酶的一個(gè)片段，它能夠?qū)δ蜔峥唆斁S酵母（K. thermotolerans）、馬克斯克魯維酵母（K. marxianus）、戴爾凱氏有孢圓酵母、季也蒙有孢漢遜酵母等產(chǎn)生有物種針對(duì)性的抗微生物效果[16]。釀酒酵母會(huì)產(chǎn)生嗜殺因子，殺滅其他某些特定的酵母菌，但它只有較窄的殺菌譜，而非釀酒酵母則具有廣譜的抗菌能力，美極梅奇酵母對(duì)腐敗酵母菌如酒香酵母/德克酵母、漢遜酵母及畢赤酵母等有廣泛的殺菌能力，但它的抗菌活性對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)沒有影響[45]。Villalba等研究發(fā)現(xiàn)，戴爾凱氏有孢圓酵母因?yàn)槟墚a(chǎn)生一種30 kDa的含有葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性的嗜殺因子，從而能作用于布魯塞爾酒香酵母（Brettanomyces bruxellensis）、膜璞畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母（P. guilliermondii）及盔形畢赤酵母（P. manshurica）等腐敗酵母菌的細(xì)胞壁，達(dá)到抑制其生長(zhǎng)的目的[46]。翟明昌等發(fā)現(xiàn)，溶氧、乙醇、pH值、氮源及生存空間的競(jìng)爭(zhēng)并不是非釀酒酵母提前衰亡的主要原因，釀酒酵母分泌的分子質(zhì)量小于10 kDa的代謝產(chǎn)物和一些分子質(zhì)量超過10 kDa的蛋白類物質(zhì)對(duì)克魯維酵母等非釀酒酵母的衰亡具有誘導(dǎo)作用[47]。顏兵等研究得到酵母代謝物對(duì)釀酒酵母的生長(zhǎng)沒有明顯的抑制作用，而異常漢遜酵母在釀酒酵母和混菌發(fā)酵濾液中，其生長(zhǎng)都出現(xiàn)了明顯的抑制作用，且混菌發(fā)酵濾液中的抑制作用更強(qiáng)[48]。目前，研究證實(shí)以蛋白化合物、寡聚肽、環(huán)化高級(jí)醇和脂肪酸等為代表的生物活性物質(zhì)在混菌發(fā)酵體系中起著重要作用，而這些化合物中，有一些被分離出來并確定了其特征（表2）。

表 2 混菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的致死因子和抑菌活性物質(zhì)Table 2 Killer toxins and other antimicrobial compounds produced during multi-starter fermentation

脂肪酸是酵母菌細(xì)胞成分中的重要組成部分，有助于維護(hù)細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性。脂肪酸作為酵母細(xì)胞中含量豐富且穩(wěn)定的一種化學(xué)組分，在不同的酵母中分布有所差異，一般而言，酵母脂肪酸多由C16脂肪酸和C18脂肪酸組成，其中主要的飽和脂肪酸是棕櫚酸，不飽和脂肪酸是棕櫚油酸和油酸，與細(xì)胞膜的流動(dòng)性和完整性密切相關(guān)。有研究表明，中長(zhǎng)鏈脂肪酸、乙酸、蛋白化合物為代表的生物活性物質(zhì)在酵母共發(fā)酵體系中發(fā)揮著重要作用，可能在相互之間產(chǎn)生不利影響[52]。Redón等研究表明，向基質(zhì)中加入棕櫚油酸，可以降低酵母細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸肽鏈長(zhǎng)度，加強(qiáng)酵母細(xì)胞的生物活性，促進(jìn)酵母生長(zhǎng)繁殖并縮短發(fā)酵時(shí)間。混合發(fā)酵中細(xì)胞產(chǎn)生的不飽和脂肪酸可用于維持細(xì)胞膜的完整性和流動(dòng)性，促進(jìn)發(fā)酵[53]。另有文獻(xiàn)報(bào)道，酵母細(xì)胞產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)中，長(zhǎng)鏈脂肪酸如十二烷酸、亞油酸、亞麻酸等的積累釋放會(huì)對(duì)不同種屬的酵母生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用[54]。

3.3 混菌發(fā)酵對(duì)果酒風(fēng)味的影響

與單一菌發(fā)酵相比，酵母菌的混合發(fā)酵能表現(xiàn)出更好的特性，Ribeiro等研究表明，由卡利比克畢赤酵母（P. caribbica）和釀酒酵母混合發(fā)酵，對(duì)酒中乙醇含量分析，發(fā)現(xiàn)其數(shù)量增加，而有機(jī)酸中乙酸含量降低，改善了成品酒整體質(zhì)量和品質(zhì)[55]。在甜葡萄酒混合發(fā)酵體系中，假絲酵母的存在減少了釀酒酵母產(chǎn)生乙酸的量[56]。但Englezos等采用假絲酵母和釀酒酵母混合發(fā)酵，相比釀酒酵母純種發(fā)酵，甘油質(zhì)量濃度略有增加（8.8～9.8 g/L），乙酸質(zhì)量濃度高達(dá)0.4 g/L[57]。多菌株混合發(fā)酵還能產(chǎn)生更加特別的香氣特征[58]，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，耐熱克魯維酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵產(chǎn)生的協(xié)同作用可增加甘油和2-苯乙醇的含量[59]。Garcia等研究發(fā)現(xiàn)，采用酵母菌混合發(fā)酵72 h后，β-葡萄糖苷酶酶活力是對(duì)照葡萄酒的2 倍，且混合培養(yǎng)發(fā)酵液中的幾種酸、醇、酯和萜烯醇的濃度大大提高，使果酒的風(fēng)味得以增強(qiáng)和改善[60]。

接種方式的差異也會(huì)影響到果酒風(fēng)味，假絲酵母和釀酒酵母連續(xù)接種發(fā)酵的酒中化學(xué)組分與假絲酵母純種發(fā)酵酒相似，而混合菌種共發(fā)酵酒中化學(xué)組分與釀酒酵母純種發(fā)酵酒相似[57]。賈言言等發(fā)現(xiàn)，非釀酒酵母梅奇酵母先于釀酒酵母接種，比同時(shí)接種和后接種，菠蘿酒風(fēng)味物質(zhì)種類及合成的羧酸酯類物質(zhì)更多，也更好地保留菠蘿原果香[61]。此外，有研究表明，采用粗糙型菌落的酵母菌和光滑型菌落的酵母菌對(duì)甘蔗汁進(jìn)行混合發(fā)酵，得到的乙醇含量要比粗糙型菌落的酵母菌單一發(fā)酵高，但比光滑型菌落的酵母菌單一發(fā)酵低；共發(fā)酵時(shí)的耗糖量也比光滑型菌落的酵母菌單一發(fā)酵的少，可能由于光滑菌株能有效水解蔗糖，釋放葡萄糖和果糖等還原糖，被粗糙菌株以較慢的速率利用[62]。

3.4 混菌發(fā)酵對(duì)基因表達(dá)和蛋白分泌的影響

丙酮酸在丙酮酸脫羧酶的作用下脫羧生成乙醛，乙醛在乙醇脫氫酶作用下還原生成乙醇，該系列步驟是酵母菌乙醇發(fā)酵的限速步驟，分別由基因PDC和ADH表達(dá)調(diào)控。釀酒酵母和球擬假絲酵母（Starmerella bombicola）混合發(fā)酵使得發(fā)酵速率增加，葡萄糖和果糖能夠被快速利用，發(fā)酵結(jié)束后，甘油、正丙醇、乙酸乙酯的含量提高，乙醇和乙酸的含量降低?；炀l(fā)酵中，PDC1活力變低，而ADH1則呈相反趨勢(shì)。發(fā)酵結(jié)束后，PDC1在混菌發(fā)酵中表達(dá)水平高于純種發(fā)酵，而ADH1基本不變[63]。Mostert等用兩種能產(chǎn)生胞外酶的非釀酒酵母（即美極梅奇酵母菌和耐熱克魯維酵母）分別和釀酒酵母共發(fā)酵，在單菌種和復(fù)合菌種發(fā)酵中，Ecm33p、Gas1p、Bgl2p和Exg1p等4 種蛋白質(zhì)始終存在，表明它們參與了細(xì)胞壁的合成，它們的合成和分泌也沒有受到酵母菌相互作用的影響，在酵母菌的生物學(xué)研究中具有關(guān)鍵作用[64]。Maturano等研究得到高濃度的糖不影響胞外酶（β-葡萄糖苷酶、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶及木聚糖酶）的活性，發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶和果膠酶的活性受到乙醇的抑制，酶活性隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低；戴爾凱氏有孢圓酵母BTd259純種發(fā)酵或與釀酒酵母BSc562混合發(fā)酵（99%戴爾凱氏有孢圓酵母）中，除β-葡萄糖苷酶外，其他胞外酶的產(chǎn)量都達(dá)到最高[65]。本課題組通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）技術(shù)研究了乙醇（體積分?jǐn)?shù)在5%～12%）脅迫條件對(duì)釀酒酵母菌Sc 131與東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis，Io166）或弗比恩畢赤酵母（Pichia fabianii，Pf 65）混合發(fā)酵供試菌基因表達(dá)的影響，再利用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證RNA-seq篩選得到的差異基因的可靠性；從差異表達(dá)基因分析結(jié)果，再利用蛋白相鄰類的聚簇（cluster of orthologous groups of proteins，COG）數(shù)據(jù)庫對(duì)其中之一菌株Io166基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類，解釋細(xì)胞生理功能與代謝（如氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、能量代謝與細(xì)胞保護(hù)功能等）在發(fā)酵過程中的分配（比例）情況。另外，從轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué)角度解釋在環(huán)境脅迫條件下酵母菌相關(guān)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、代謝通路及生理功能等的變化，從而來分析酵母菌發(fā)酵行為的影響機(jī)制，該研究在進(jìn)一步進(jìn)行之中。

4 結(jié) 語

利用酵母菌混合發(fā)酵來提高果酒品質(zhì)和感官特性已經(jīng)在釀酒業(yè)廣泛應(yīng)用。酵母菌混合發(fā)酵的大量研究側(cè)重于對(duì)酒體風(fēng)味成分的影響，也有部分通過不同接種方式來研究代謝物產(chǎn)生的差異，但對(duì)于混合發(fā)酵過程中的酵母菌之間相互作用機(jī)制及環(huán)境脅迫對(duì)酵母菌共發(fā)酵的影響尚未深入了解；通過對(duì)酵母菌相互作用及環(huán)境對(duì)混合酵母菌作用的認(rèn)識(shí)，有助于對(duì)發(fā)酵過程中非目標(biāo)酵母菌和目標(biāo)酵母菌進(jìn)行控制和管理，獲得滿足人們需求的高品質(zhì)果酒。另外，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的興起，已有部分學(xué)者從純種和混菌發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)分泌和基因表達(dá)差異性方面來揭示混合共發(fā)酵體系中不同酵母菌之間的關(guān)系和協(xié)同作用機(jī)制，通過以上研究，酵母菌多菌種發(fā)酵的代謝機(jī)理將會(huì)得到更加深入和全面的闡述。