紫外線照射實驗動物的皮膚光老化模型研究進(jìn)展

王詩萌 李甜 楊田野

[摘要]皮膚像人類其他器官一樣，隨時間而衰老。但又不同于其他器官，影響皮膚衰老的一項重要的環(huán)境因素是紫外線輻射。隨著大氣臭氧空洞的增加、環(huán)境光污染的加重及人們生活水平的提高，大家越來越注重皮膚因光損傷導(dǎo)致的紅斑、皺紋、色沉、彈性減弱等問題。對光老化皮膚的治療方法則更是目前的研究熱點，但因自然光老化是一個十分漫長的過程，所以有關(guān)光老化的實驗大多建立在光老化實驗動物模型的基礎(chǔ)上。因此，建立一個可靠的更接近于人類皮膚自然光老化的模型具有重要意義。本文就當(dāng)前光老化的發(fā)生機制、光老化模型造模方法、檢測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展歸納總結(jié)如下。

[關(guān)鍵詞]皮膚衰老；光老化；抗衰老；動物模型；紫外線輻射

[中圖分類號]R339.3+8 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）07-0146-05

Abstract：Skin，like other human organs， skin anginghappens with time. But different from other organs， an important environmental factor affecting skin aging is ultraviolet radiation . With the increase of ozone hole in the atmosphere， the aggravation of environmental light pollution and the improvement of people's living standard， people pay more and more attention to the changes of skin caused by photo damage and photoaging， such as erythema， wrinkles， pigmentation and elasticity decline. Therefore， the research on the mechanism and treatment of photoaging has become a hot topic. However， natural photoaging is a long process， so most of the experiments of photoaging is a step after the establishment of the experimental animal model of photoaging. Therefore， it is important to establish a reliable model closer to the natural photoaging of human skin. This review mainly summarizedthe mechanism of photoaging， the modeling methods of photoaging， and the progress of detection standard.

key words： skin aging； photoaging； anti-aging； animal model； UV radiation

皮膚是人體最大的器官，并作為人體的第一道防線，保護(hù)著人體免受外界理化因素及微生物的侵襲。但與此同時，它也是最容易受外界環(huán)境影響的器官，其中紫外線、寒冷、風(fēng)吹及化學(xué)暴露均可導(dǎo)致皮膚受損及老化，而紫外線是誘發(fā)人類皮膚光老化所有因素中最重要的一個[1-2]。光老化的外觀特點是皮膚粗糙，皺紋加深并伴有色素沉著，病理特點是表皮角化不良伴異常增生，真皮變薄、膠原減少、彈性纖維降解等[3]。而紫外線在誘導(dǎo)光老化的同時，也可以引起多種皮膚病變，甚至是皮膚惡性腫瘤。所以光老化在當(dāng)代已經(jīng)以一種疾病及綜合征的姿態(tài)而成為研究熱點[4-5]?，F(xiàn)今對于抗光老化的治療研究中，由于存在倫理限制及不便因素，研究者們常常先建立起實驗動物光老化模型后，再進(jìn)行下一步治療研究。但由于光老化發(fā)生機制復(fù)雜、臨床表現(xiàn)多樣，如何建立起更具有代表性及更貼近于人類光老化皮膚的模型，尚缺乏一定評價標(biāo)準(zhǔn)。本文通過對光老化的發(fā)生機制、目前國內(nèi)外常用的光老化實驗動物及照射光源的選擇進(jìn)行一定歸納，并最后總結(jié)出評價光老化的研究指標(biāo)，以期為進(jìn)行實驗的研究者提供參考。

1 光老化的發(fā)生機制

太陽發(fā)射多種色譜光源，波長各不相同并相互作用，包括紫外線（ultraviolet， UV）、可見光和紅外線（Infrared Radiation，IR）。光老化的發(fā)生機制不僅復(fù)雜又相互作用，其主要機制及學(xué)說有：細(xì)胞基質(zhì)異常降解、自由基及線粒體突變學(xué)說、免疫抑制及炎癥浸潤等[6]。從分子機制講，UV輻射可以使大量的活性氧自由基（ROS）得到累積，一方面ROS可以使端?？s短，另一方面又可以損傷核DNA，同時又可活化細(xì)胞表面受體，誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄復(fù)合物活性蛋白（activator，protein，AP-1）活化，而AP-1的主要作用就是抑制膠原蛋白合成、促進(jìn)膠原蛋白分解，同時又參與免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）的轉(zhuǎn)錄（MMP是一種膠原酶，可促進(jìn)膠原降解）；而AP-1不僅會阻止轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-β）轉(zhuǎn)錄及還會降低TGF-β受體水平，從而抑制膠原合成[7-8]。

自然光中的紫外線按照不同的波段，又分為UVA（ultraviolet， UVA）、UVB（ultraviolet， UVB）、UVC（ultraviolet， UVC）。由于UVC在穿過地球時會被臭氧吸收，所以紫外線所引起的皮膚光老化基本可以看作是UVA及UVB的作用。簡單地說，UVA通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK） 信號傳導(dǎo)通路，促進(jìn) MMPs表達(dá)生成，抑制膠原的合成[9-10]。而UVB則通過抑制機體免疫系統(tǒng)，促進(jìn)MMPs表達(dá)生成，抑制膠原的合成[2，11]。日光中紅外線和熱量可以誘導(dǎo)皮膚新生血管的生成[12]。CHO[13]曾經(jīng)通過研究證實，IR和熱能夠誘導(dǎo)皮膚新生血管和炎癥性細(xì)胞浸潤，再通過MMPs破壞真皮的細(xì)胞外基質(zhì)，改變皮膚的結(jié)構(gòu)蛋白，從而加速皮膚的光衰老表現(xiàn)。

2 光老化的分型

光老化的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣且程度不同，進(jìn)行光老化的分型研究有助于我們在光老化的模型研究中進(jìn)行分類描述?，F(xiàn)今仍然沿用的是Glogau分型，它是通過對患者的不同臨床表現(xiàn)程度及情況進(jìn)行光老化分型[10]，見表1。

3 光老化與自然老化的區(qū)別

自然情況下，隨著人類年齡的增長及外出活動的影響，在光老化和自然老化同時相疊加的作用，形成了人類老年時的皮膚臨床表現(xiàn)。然而，自然老化與光老化，因其機制不同，而形成不同的區(qū)別表現(xiàn)。了解這些區(qū)別有助于我們建立更貼近于人類皮膚衰老的模型。劉瑋等[14]曾經(jīng)根據(jù)年齡、原因、影響因素、范圍、臨床及組織學(xué)特征、并發(fā)腫瘤等方面對皮膚光老化和皮膚自然老化進(jìn)行區(qū)別，見表2。

4 光老化模型實驗動物的選擇

在模型動物選擇方面，可以選擇嚙齒類的實驗鼠和及小型豬。但因為小型豬具有難飼養(yǎng)，價格高以及難以操作等缺點，所以國內(nèi)外大多學(xué)者選用更易于操作和飼養(yǎng)的實驗鼠作為光老化模型動物。20世紀(jì)80年代，國外研究者使用Skh-1（hr/hr）無毛小鼠，成功地模擬出了光老化的皮膚[15]，并且認(rèn)為該小鼠的皮膚組織學(xué)改變十分貼近人類皮膚光老化改變[16]。SKH-1無毛小鼠由Charles Rive從斯坦福大學(xué)引進(jìn)，它因具有穩(wěn)定無毛基因，是國外常用的皮膚病、皮膚腫瘤及皮膚光老化損傷的動物模型，但因價格昂貴限制了其在國內(nèi)的應(yīng)用。2015年，Jeong[17]首次使用裸鼠（nu/nu）作為光老化模型實驗動物，并發(fā)現(xiàn)因為裸鼠的修復(fù)能力較強，所以其最小紅斑計量（MED）比無毛老鼠更大，需要更頻繁的照射。裸鼠因同樣具有無毛特征、無胸腺缺乏細(xì)胞免疫，因而更適合進(jìn)行光老化模型后的人細(xì)胞治療實驗，而成為研究學(xué)者探討后續(xù)干細(xì)胞治療的熱門動物。但因裸鼠的飼養(yǎng)及環(huán)境需要較高的清潔等級，限制了其國內(nèi)應(yīng)用。由于各種因素，國內(nèi)學(xué)者常常選擇使用人工脫毛后的SD大鼠作為光老化模型動物[4-5，18]。然而在自然狀態(tài)下，SD大鼠因喜夜間活動所以并不會受到紫外線的照射而產(chǎn)生光老化皮膚改變，同時反復(fù)多次人工脫毛會給皮膚帶來一定的刺激，影響實驗結(jié)果，所以SD大鼠并不適合作光老化模型動物[19]。

5 造模的紫外線光源選擇

從上述光老化的發(fā)生機制中可以看出，UVA及UVB是引起光老化發(fā)生的主要影響因素。UVA是指波長315～400nm的紫外線，穿透能力較強，可穿透表皮至皮膚基底層和真皮層，是皮膚變黑的主要元兇；UVB是指波長280～320nm的紫外線，易被表皮所吸收，主要引起皮膚紅斑、皮膚皺紋粗糙加深[2]。根據(jù)不同的實驗需求及實驗室環(huán)境，研究人員選擇的輻照光源往往不同。由于老鼠的皮膚常常較人皮膚薄，所以有許多學(xué)者選擇用穿透能力不是那么強的UVB作為光源。但在自然日光中UVA的劑量是UVB的500～1 000倍，所以也有許多學(xué)者選擇用UVA+UVB光源同時照射來模仿自然狀態(tài)下的光照[4，20]。

6 造模過程中的注意事項

6.1 紫外線的危害：紫外線照射具有殺菌作用，可以影響和調(diào)節(jié)人體呼吸、循環(huán)及免疫系統(tǒng)等，但過量的紫外線照射，會危害人體健康，甚至?xí)痣姽庑匝垩准鞍變?nèi)障[21]。Podskochy等[22]采用波長310nm的紫外線照射兔眼角膜76h后，兔眼的角膜出現(xiàn)細(xì)胞損傷、水腫、混濁的改變。所以在造模的過程中，實驗員及實驗動物都應(yīng)該進(jìn)行一定的保護(hù)措施，以避免紫外線給實驗動物帶來除光老化的其他副損傷，而影響實驗結(jié)果。

6.2 最小紅斑劑量的確定：最小紅斑量（Minimal erythema dose， MED）是指在一定光源或特定波段光線照射下所引起的照射部位在24h后仍可察覺紅斑的最小照射劑量[23]，通常由兩名以上有豐富經(jīng)驗的觀察者所判定。基本在所有文獻(xiàn)中，研究員均以MED為起始照射劑量，并以周為單位逐漸遞增照射劑量。然而在不同的文章中，即使是同一種實驗動物，其最MED、照射頻率卻不盡相同。雖然MED的定義明確，但實際MED的值卻較難判斷，給實驗帶來了一定的困難。所以在進(jìn)行實驗之前，一定要進(jìn)行預(yù)實驗判斷MED，摸索照射劑量，才能最大地減小影響實驗結(jié)果的因素。

7 檢測標(biāo)準(zhǔn)的選擇

光老化模型是一個影響因素多、耗時長、檢測指標(biāo)復(fù)雜的模型。雖然光老化的實驗?zāi)Ｐ脱芯繑?shù)量較多，但對于光老化模型成功的檢測方法常常見仁見智。筆者通過閱讀大量文獻(xiàn)，歸納出光老化的評價指標(biāo)大多集中在大體肉眼觀察、三維掃描或皺褶復(fù)制品分析法、病理切片及特殊染色的鏡下觀察、免疫組化定量分析。具體檢查指標(biāo)，見表3。

從表3可以看出，I型膠原蛋白的檢測至關(guān)重要，這從光老化的發(fā)生機制可推斷出，老化的外觀改變主要是由于皮膚膠原的成分及性狀改變。人類皮膚中的膠原主要由I型和Ⅲ型膠原組成，I型膠原占85%，既可以維持皮膚飽滿充盈又可以承受拉力；而Ⅲ型膠原是幼稚膠原，膠原纖維較細(xì)；日光的照射影響了Ⅰ型膠原的合成，改變了Ⅰ型和Ⅲ型膠原比例，從而導(dǎo)致了皮膚松弛、彈性降低、皺紋加深的臨床表現(xiàn)[25]。所以，在驗證光老化模型是否成功時，應(yīng)有一定的對于皮膚膠原檢測的實驗結(jié)果。但值得注意的是，影響皮膚膠原蛋白含量的因素不僅只有紫外線。因此，僅有膠原含量的檢測并不能代表光老化模型成功，還應(yīng)該結(jié)合光老化發(fā)生機制對組織中進(jìn)行AP-1、MMP、SOD，甚至是細(xì)胞中ROS的檢測。

8 小結(jié)與展望

綜上所述，光老化模型實驗影響因素較多、成本較高、耗時較長。選擇不同的實驗動物、MED、照射頻率、紫外線光源等均可較大地影響到光老化模型的檢測指標(biāo)。筆者通過閱讀國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)裸鼠因其具有以下優(yōu)勢，成為學(xué)者們常用的光老化實驗動物：①裸體無毛，免除了脫毛給皮膚帶來刺激和損傷，減少了實驗影響因素；②光老化裸鼠的皮膚與人皮膚老化改變相似[19]。但是裸鼠本身皮膚松弛，幼年裸鼠皮膚便有大量褶皺，這對模擬人類正常老化中的皺紋具有一定影響，加之其表皮十分菲薄，較低的照射劑量即可造成皮膚損傷，出現(xiàn)表皮破損、出血，如此反復(fù)還會生成瘢痕。而一旦形成瘢痕，則會因瘢痕存在的大量膠原組織而影響最終膠原的檢測，從而導(dǎo)致實驗失敗。所以，把握準(zhǔn)確的MED及照射劑量是實驗關(guān)鍵。筆者認(rèn)為MED不僅與動物本身的種類、年齡、皮膚薄厚程度不同而不同，還與實驗室本身的環(huán)境有關(guān)。所以，如果使用裸鼠作光老化動物模型，一定要開展本實驗室的模擬預(yù)實驗，切不可參照其他文獻(xiàn)照射劑量而盲目開始照射。

光老化造模的時間相對較長，根據(jù)不同動物皮膚厚度不同，照射劑量亦不同。但無疑過長的紫外線照射會致動物眼睛損傷，一旦損傷則會給實驗帶來干擾因素，影響實驗結(jié)果。所以，為了確保照射劑量較準(zhǔn)確，照射部位精準(zhǔn)，照射時固定實驗動物是一個不錯的選擇。麻醉雖然操作簡單，但難以控制麻醉劑量，易致死，而且光老化照射次數(shù)多，反復(fù)麻醉不推薦使用。如果可以就不同的實驗動物進(jìn)行頭部及重要部位的遮擋及四肢固定，這樣既可以進(jìn)行自身照射后效果對比，又可以簡易地判斷MED，是較為理想的照射方法。

未來，隨著人類科技的不斷進(jìn)步，求美者的不斷增多，治療光老化皮膚的方法將多種多樣?，F(xiàn)已有多篇文章證明了脂肪干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、維甲酸、點陣激光等均具有治療皮膚光老化的作用[17，26-28]。鑒于這一特點，未來光老化老模型必定會在對抗衰治療的探索中不斷完善，更加與人類衰老皮膚相似。

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[收稿日期]2018-05-07 [修回日期]2018-06-22

編輯/李陽利