曲海艷，袁正杰，潘龍玉，何海燕，許趙蒙，瞿紹洪，*

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所，浙江 杭州 310021)

水稻紋枯病是由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的水稻病害，是世界水稻三大病害之一[1-2]。水稻對紋枯病的抗性屬于典型的數(shù)量遺傳性狀[3]，易受環(huán)境影響。目前，尚未發(fā)現(xiàn)高抗或免疫的水稻種質(zhì)材料。此外，在水稻紋枯病的早期階段，通過對病癥的目測不容易觀察到紋枯病菌的侵染。這些不利因素嚴(yán)重阻礙了水稻紋枯病的防治和抗病育種研究[2]。

目前，水稻抗紋枯病種質(zhì)篩選和QTL抗性鑒定，主要通過對水稻紋枯病發(fā)病的嚴(yán)重程度和對不同水稻品種的抗感性差異進(jìn)行視覺評估。在水稻分蘗末期接種紋枯菌的田間抗性鑒定方法[4]，具有鑒定結(jié)果比較穩(wěn)定可靠的優(yōu)點，但是工作量大，試驗周期長，且易受季節(jié)限制。Jia等[5]針對苗期水稻紋枯病的接種，建立了用可樂瓶營造接種植株微環(huán)境的“微室”接種法。但總體而言，該方法在溫室接種條件下還存在不精細(xì)、不穩(wěn)定等問題，水稻的接種苗齡、接種操作步驟、病情評價體系等尚不統(tǒng)一，試驗數(shù)據(jù)的可重復(fù)性有待提高。由Prasad等[6]建立的離體葉片接種方法，雖然取材方便、操作快速簡便，但是依賴目測病斑面積，難以對病菌擴(kuò)展和水稻發(fā)病程度進(jìn)行準(zhǔn)確測量。我們對離體葉片接種方法進(jìn)行了改進(jìn)：將目測調(diào)查評價接種樣品紋枯病級的方式，改為通過病斑面積分換算來計算接種葉片的相對發(fā)病面積，從而對發(fā)病程度進(jìn)行量化檢測[7]。

基于病斑目測評估進(jìn)行水稻紋枯病病級鑒定的各種方法，均易受到評估者主觀差異的影響。在比較不同評估人員的研究結(jié)果時，這種個體差異顯得尤為突出。Sayler等[8]利用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)方法，對水稻離體葉片紋枯病接種材料，進(jìn)行紋枯病菌量的檢測，從而對病菌擴(kuò)展和水稻發(fā)病程度進(jìn)行定量分析。為了有效地運用接種水稻組織紋枯菌相對含量的qPCR檢測方法，我們結(jié)合本實驗室改進(jìn)的水稻離體葉片紋枯病接種方法[7]，對我國水稻品種材料的紋枯病抗性差異進(jìn)行了鑒定。通過精確控制接種條件，掃描離體葉片的病斑和統(tǒng)計分析相對病斑面積，準(zhǔn)確驗證了以上qPCR檢測方法的結(jié)果。通過大田接種試驗進(jìn)一步證明，以上關(guān)于紋枯病菌DNA的qPCR方法，能夠快速有效地檢測不同水稻材料間的紋枯病抗性差異。這將為量化真菌的侵染程度、評價水稻品種的抗性水平、快速篩選水稻紋枯病抗性種質(zhì)和進(jìn)行紋枯病的早期預(yù)報，提供有效的檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻品種為：紋枯病抗性材料YSBR1[9]，感病材料Lemont[9]、泰粳394[10]、臺北309[11]和徐稻3號[12]。供試紋枯病菌系YN-7由揚州大學(xué)潘學(xué)彪教授惠贈。

1.2 水稻離體葉片紋枯病接種

1.2.1 水稻種植

將水稻種子封裝于羊皮紙袋中，進(jìn)行浸種發(fā)芽。發(fā)芽至第6天，將長勢一致的稻芽點播于育秧田中。播種25 d后將生長狀況良好的秧苗移栽至大田。在水稻分蘗后期(移栽后大約30 d)，選取葉色濃綠、生長健壯且無病蟲害的分蘗，取其完全展開的倒一葉或倒二葉，進(jìn)行水稻紋枯病離體接種。

1.2.2 紋枯菌培養(yǎng)

活化培養(yǎng)：將帶有紋枯菌菌絲的瓊脂塊通過無菌手術(shù)刀切成0.4～0.5 cm2小塊，接種到四環(huán)素濃度為0.005%的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基的平板上。封口膜封口后，倒置于28 ℃培養(yǎng)箱中，活化培養(yǎng)2～3 d，至白色菌絲長滿培養(yǎng)基表面時取出。

擴(kuò)大培養(yǎng)：將來自活化培養(yǎng)的0.4～0.5 cm2菌塊，接種到新的PDA培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)2～3 d，至白色菌絲長滿培養(yǎng)基表面時取出，備用。

1.2.3 水稻離體葉片的紋枯病菌接種

取分蘗后期水稻葉片，剪取4 cm長的中間部分，使葉片背軸面向上，平鋪在含有苯并咪唑(0.000 1 g·mL-1)的水瓊脂培養(yǎng)基(0.005 g·mL-1)表面。在擴(kuò)大培養(yǎng)的長滿紋枯病菌的培養(yǎng)基相同半徑處，用表面滅菌的打孔器，取帶有菌絲的PDA瓊脂塊，直徑約7 mm。將菌塊放置于離體葉片的中間部位，帶有菌絲的一面緊貼葉片背軸面。封口膜封口后，移至28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。不同水稻材料各取1塊離體葉組織，放入含有水瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，接種紋枯病菌。1個培養(yǎng)皿視作1個接種重復(fù)。另外取同一套水稻材料，接種無菌瓊脂塊，作為對照。

1.2.4 水稻離體葉片接種后病斑面積的測量

接種處理72 h后，用數(shù)字掃描儀對同一培養(yǎng)皿的不同水稻材料的離體葉片進(jìn)行掃描。利用Photoshop軟件，將掃描照片的病斑面積換算為像素，用公式計算相對病斑面積(relative lesion area，RLA)[13]。通過Tukey法，分別用紋枯病菌株YN-7對每個水稻品種接種2次，每次6個重復(fù)(6皿)；通過積分換算方法，計算相對病斑面積，進(jìn)而確定不同品種的紋枯病抗性。然后對各水稻品種的平均相對病斑面積進(jìn)行方差分析和多重比較，具體參見馬晨燕等[7]。

1.3 水稻葉片紋枯病接種樣品的菌量檢測

1.3.1 接種紋枯病菌水稻葉片組織的取樣和DNA提取

分別在接種24 h和48 h后，于無菌操作臺中打開培養(yǎng)皿，從YN-7菌株和無菌對照處理取接種的離體水稻葉片。每塊離體葉組織剪取以瓊脂塊為中心的菌絲擴(kuò)展區(qū)域(葉片徑向約3 cm長)，3～4塊葉組織混合，迅速置于液氮冷凍，然后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA提?。喝?00 mg帶菌絲的葉片組織，液氮研磨，加入400 μL提取緩沖液(0.3 mol·L-1NaCl，50 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.5，20 mmol·L-1EDTA，2%肌氨酰，0.5%十二烷基硫酸鈉，5 mol·L-1尿素)，再加入400 μL苯酚/氯仿混合液(體積比1∶1，pH 8.0)，渦旋振蕩10 min，14 000 r·min-1離心5 min。取上清轉(zhuǎn)移到新的離心管，加入2 μL RNase(10 mg·mL-1)，渦旋振蕩幾秒鐘，37 ℃下保溫1 h。加入0.7倍體積的異丙醇；14 000 r·min-1離心5 min；DNA沉淀用70%乙醇洗滌，干燥。提取的DNA樣品用100 μL Tris (10 mmol·L-1)-EDTA (1 mmol·L-1)溶解，再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA質(zhì)量，用NanoDrop紫外-可見分光光度計(NanoDrop 8000 UV-Vis Spectrophotometer)檢測DNA濃度和純度。

1.3.2 紋枯病qPCR分析的引物與標(biāo)準(zhǔn)曲線

參照Sayler等[8]檢測水稻離體葉片接種樣品中紋枯病菌含量的方法，紋枯菌基因組保守序列的特異引物(Rs-F/Rs-R)以及水稻基因組特異引物(RUBQ-F/RUBQ-R)見表1。Rs-F和Rs-R來自紋枯菌AG-1 IA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)SPM2序列(GenBank accession number KX674525.1)，RUBQ-F和RUBQ-R來自水稻泛素基因序列(LOC_Os06g46770; GenBank accession number AP014962.1)。以接種葉片組織的提取DNA為模板，分別用Rs-F/Rs-R和RUBQ-F/RUBQ-R引物對進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過TA克隆和測序驗證。

在ABI PRISM7900 qPCR檢測系統(tǒng)上進(jìn)行qPCR反應(yīng)。采用SYBR?qPCR Mix試劑盒(TOYOBO公司)。每個qPCR反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)。反應(yīng)體系(25 μL)為：12.5 μL Mix，1 pmol·L-1引物，100 ng DNA。反應(yīng)程序為：95 ℃，15 min；95 ℃，15 s；52 ℃，30 s；72 ℃，15 s；40個反應(yīng)循環(huán)；95 ℃，1 min；55 ℃，30 s。

從單純培養(yǎng)紋枯病菌的PDA培養(yǎng)基采取菌絲，提取紋枯病菌DNA。以10倍梯度(100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg)，稀釋紋枯病菌DNA。以梯度稀釋的樣本為模板，用紋枯菌特異引物Rs-F/Rs-R，進(jìn)行qPCR實驗，每個樣本設(shè)置3個重復(fù)，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 接種水稻葉片紋枯病菌DNA的定量PCR分析

以接種葉片組織的提取DNA為模板，利用紋枯菌及水稻特異引物(表1)，分別進(jìn)行定量qPCR分析。根據(jù)紋枯菌SPM2序列和水稻泛素基因的qPCR數(shù)據(jù)，分別估算紋枯病菌DNA含量和水稻DNA含量，進(jìn)而計算紋枯病菌DNA含量和水稻DNA含量的比值(ngR.solaniDNA/1 ng rice DNA)。設(shè)置3次重復(fù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

1.4 水稻大田成株期紋枯病接種鑒定

2017年5—10月在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田進(jìn)行水稻品種YSBR1、Lemont和泰粳394的大田成株期紋枯病接種試驗。水稻種子于5月12—18日發(fā)芽，5月19日播種。秧苗于6月20日移栽大田，每個小區(qū)栽插2行，每行12個單株。每個品種種植2次，隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。在水稻分蘗后期(2017年8月23日)，取每個小區(qū)第 1行(即接種行)的9～10個植株，每株取3個分蘗，采用嵌入法[14-15]，接種紋枯病菌系YN-7。在抽穗后30 d(10月5—12日)，采用Rush等[16]的0～9級病情評價體系，取接種行中間的7～8個接種植株，計算分蘗的紋枯病平均病級作為單個植株病級。對各水稻品種的紋枯病病級進(jìn)行方差分析和多重比較[7]。

表1紋枯病菌與水稻泛素基因的特異性引物

Table1Primers specific forR.solaniAG-1 IA and the rice ubiquitin gene

引物Primer基因號Gene ID引物序列Primer sequence(5'-3')參考文獻(xiàn)ReferenceRsKX674525.1F: GCCTTTTCTACCTTAATTTGGCAGR: GTGTGTAAATTAAGTAGACAGCAAATG[8]RUBQOs06g46770F: GTGGCCAGTAAGTCCTCAGCR: GAAACGGGACACGACCAAGG[8]

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻紋枯菌PCR產(chǎn)物測序驗證和qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

本研究的接種試驗與Sayler等[8]試驗的紋枯病菌系和水稻品種均不一樣，所以PCR引物和擴(kuò)增序列需要進(jìn)一步驗證。根據(jù)紋枯菌AG-1 IA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)SPM2序列(GenBank登錄號：KX674525.1)，在Rs-F和Rs-R引物的擴(kuò)增序列的外圍，分別延長50～100 bp，再次設(shè)計驗證引物。以水稻紋枯病菌系YN-7的提取DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過TA克隆和測序、比對，結(jié)果表明，YN-7擴(kuò)增序列與以上SPM2序列完全一致，因此Rs-F和Rs-R引物適用于本研究的qPCR實驗。用梯度稀釋的YN-7菌系的DNA為模板和Rs-F/Rs-R引物，進(jìn)行qPCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。Ct值與稀釋YN-7菌系DNA的log值呈負(fù)線性關(guān)系(R2=0.998 6)。

Y，Ct值；X，紋枯病菌DNA含量的對數(shù)值。Y，Cycle threshold (Ct) value; X，log R. solani DNA content.圖1 qPCR檢測中紋枯病菌DNA含量與Ct值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve showing the linear relationship between R. solani DNA content and Ct value in qPCR

2.2 接種葉片紋枯菌DNA含量的qPCR檢測

從YSBR1、Lemont、泰粳394、臺北309和徐稻3號的分蘗期水稻植株，接種處理后提取水稻葉片組織的DNA。采用圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過qPCR方法檢測不同水稻材料葉片組織中紋枯菌DNA的相對含量。如圖2所示，將相同水稻品種48和72 h接種時間點的接種樣品進(jìn)行比較，72 h時紋枯病菌DNA的相對含量，均高于相應(yīng)48 h樣品的相對含量。在48和72 h接種時間點，YSBR1接種樣品中紋枯病菌DNA的相對含量，均低于相應(yīng)時間點的其他水稻品種接種樣品的相對含量。說明YSBR1的紋枯病抗性最強(qiáng)。依此類推，徐稻3號、臺北309和泰粳394的紋枯病菌相對含量依次增加，說明其紋枯病抗性依次減弱。Lemont接種樣品的紋枯病菌相對含量最高，因而對紋枯病菌最為敏感。

ng R.solani DNA/100 ng total DNA：接種組織每100 ng總DNA中紋枯菌DNA的含量。ng R.solani DNA/100 ng total DNA: R. solani DNA content in every 100 ng total DNA of inoculated tissue.圖2 接種組織總DNA中紋枯菌DNA的qPCR分析Fig.2 qPCR analysis of R. solani DNA in the total DNA of inoculated tissues

紋枯病菌侵染的葉片樣品的水稻生物量，可以通過水稻泛素基因qPCR檢測指標(biāo)進(jìn)行估算[8]。用梯度稀釋的未接種水稻的DNA模板和泛素基因引物進(jìn)行qPCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)。結(jié)果顯示，Ct值與水稻DNA含量log值呈負(fù)線性關(guān)系(R2=0.997 1)。

根據(jù)紋枯菌SPM2序列和水稻泛素基因的qPCR數(shù)據(jù)，估算不同水稻品種的接種組織中紋枯菌與水稻DNA的比值(圖4)，進(jìn)而估算接種樣品的紋枯菌相對含量。與圖2的結(jié)果一致，相同水稻品種的72 h樣品中紋枯病菌含量，均高于其48 h樣品中的相應(yīng)含量；在48和72 h接種時間點，各水稻品種的接種樣品的紋枯病菌DNA含量，從低到高的順序均為：YSBR1、徐稻3號、臺北309、泰粳394和Lemont(圖4)。

2.3 水稻離體葉片紋枯病接種樣品相對病斑面積的統(tǒng)計分析

從YSBR1、Lemont、徐稻3號、臺北309和泰粳394的分蘗期水稻植株，取離體葉片，進(jìn)行了2次紋枯病菌接種。在72 h時，各品種的葉片出現(xiàn)面積大小不等的紋枯病病斑。YSBR1葉片的大部分保持青綠色，病斑面積較??；Lemont葉色發(fā)黃，病斑蔓延葉片2/3以上；泰粳394、臺北309和徐稻3號離體葉片上面分別有不同程度的病斑蔓延面積。

Y，Ct值；X，水稻DNA含量的對數(shù)值。Y，Cycle threshold (Ct) value; X，log rice DNA content.圖3 qPCR檢測中水稻DNA含量與Ct值關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve showing the linear relationship between rice DNA content and Ct value in qPCR

ng R. solani DNA/1 ng rice DNA：接種組織中紋枯菌和水稻DNA含量的比值。ng R. solani DNA/1 ng rice DNA: ratio of R. solani DNA and rice DNA in the inoculated tissue.圖4 接種組織紋枯菌和水稻DNA相對含量的qPCR分析Fig.4 qPCR quantification of the relative content of R. solani and rice DNA in inoculated tissues

利用數(shù)字掃描儀，對72 h接種時間點的離體葉片進(jìn)行病斑掃描。用Photoshop軟件，將掃描照片上的病斑面積進(jìn)行像素?fù)Q算(圖5)，計算相對病斑面積(RLA)，然后對 YSBR1、Lemont 和泰粳394的RLA數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(表2)。在2次重復(fù)離體葉片接種試驗中，YSBR1、泰粳394與Lemont之間的RLA數(shù)據(jù)均表現(xiàn)有顯著差異(P<0.05)；臺北309和徐稻3號與以上3個水稻品種之間的RLA數(shù)據(jù)也均表現(xiàn)有顯著差異(P<0.05)，但是臺北309與徐稻3號兩者之間的RLA數(shù)據(jù)沒有顯著差異。因此，離體葉片接種樣品相對病斑面積的統(tǒng)計分析結(jié)果，進(jìn)一步驗證了各水稻品種對紋枯病菌抗感程度的差異。

2.4 供試水稻品種田間成株期接種驗證

對YSBR1、Lemont和泰粳394進(jìn)行了大田成株期紋枯病接種試驗。根據(jù)Rush等[16]的0～9 級病情評價體系，YSBR1、Lemont和泰粳394的平均病級分別為4.47、9.00和6.90，相互呈顯著差異。上述結(jié)果進(jìn)一步驗證了抗病品種YSBR1分別與感病品種泰粳394和Lemont之間的紋枯病病級差異，以及感病品種泰粳394和Lemont之間的病級差異。

紋枯病菌株YN-7侵染水稻離體葉片72 h后病斑掃描(A)與Photoshop軟件處理結(jié)果(B)。R.solani strains YN-7 was inoculated to rice cultivars. Scanned lesions (A) and Photoshop software processing results (B).圖5 水稻離體葉片接種紋枯病菌的病斑掃描Fig.5 Digital scanning of the sheath blight lesions on detached rice leaves infected with R.solani

表2紋枯菌侵染水稻離體葉片相對病斑面積的統(tǒng)計分析

Table2Statistical analysis of the relative lesion area of detached rice leaves infected withR.solani

試驗Experiment水稻品種Cultivar各接種重復(fù)相對病斑面積Relative lesion area of each repeat123456平均Average第1次YSBR10.01 0.04 0.03 0.00 0.04 0.04 0.03 dThe first experiment徐稻3號Xudao No.30.13 0.12 0.17 0.13 0.16 0.13 0.14 c臺北309 Taibei 3090.15 0.14 0.14 0.19 0.22 0.15 0.16 c泰粳394 Taijing 3940.38 0.33 0.35 0.35 0.33 0.32 0.34 bLemont0.57 0.58 0.57 0.59 0.49 0.67 0.58 a第2次YSBR10.05 0.02 0.03 0.01 0.02 0.01 0.02 dThe second experiment徐稻3號Xudao No.30.17 0.14 0.16 0.15 0.20 0.14 0.16 c臺北309 Taibei 3090.15 0.23 0.13 0.13 0.24 0.12 0.17 c泰粳394 Taijing 3940.38 0.49 0.34 0.40 0.41 0.38 0.40 bLemont0.71 0.60 0.61 0.54 0.55 0.57 0.60 a

標(biāo)注不同字母的平均病斑面積之間存在顯著差異(P<0.05)。

The average lesion areas labelled with different letters showed significant difference (P<0.05).

3 討論

本研究根據(jù)馬晨燕等[7]對水稻離體葉片紋枯病接種方法的改進(jìn)，對接種條件進(jìn)行更精確的控制，進(jìn)而對離體葉片的紋枯菌DNA進(jìn)行qPCR檢測。與Sayler等[8]對離體葉片紋枯病病斑長度的測量方法相比較，本研究采用的病斑掃描和計算相對病斑面積的方法，在關(guān)于紋枯病菌株YN-7的2次重復(fù)接種試驗中，都取得了顯著差異的結(jié)果。大田水稻紋枯病接種試驗進(jìn)一步驗證了各品種的紋枯病抗性差異的結(jié)果。因此，改進(jìn)的離體葉片接種方法與紋枯菌DNA的qPCR檢測可以結(jié)合起來，具有快速簡便和易于重復(fù)的優(yōu)點，適用于大規(guī)模水稻種質(zhì)材料抗紋枯病性狀的篩選。此外，在水稻發(fā)病早期，通過目測難以觀察到紋枯菌侵染和病癥[3]。因此，水稻組織中紋枯菌DNA的qPCR檢測方法可以用于水稻生產(chǎn)中紋枯病的早期預(yù)報和防治。

表3水稻大田成株期紋枯病接種的病級

Table3The sheath blight scores of rice adult plants inoculated withR.solanion field

品種Cultivar大田水稻植株的紋枯病病級Sheath blight score of rice plants on field植株數(shù)Plant number平均病級AverageYSBR15.00 4.50 4.00 4.00 4.00 5.00 4.50 5.00 164.47 c4.00 3.00 4.50 4.00 5.00 4.00 7.00 4.00 泰粳394 Taijing 3947.00 7.00 7.00 7.00 5.00 7.00 7.00 7.00 156.90 b7.00 7.50 7.00 7.00 7.00 6.00 8.00Lemont9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 169.00 a9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00 9.00

標(biāo)注不同字母的平均病級之間存在顯著差異(P<0.05)。

The average disease scores labelled with different letters showed significant difference (P<0.05).

根據(jù)水稻離體葉片紋枯病菌DNA的qPCR分析結(jié)果，相同接種材料72 h時間點的紋枯病菌含量明顯高于48 h時間點的相應(yīng)含量。在48和72 h接種時間點，均能檢測到各水稻品種接種樣品中紋枯病菌含量的差別和變化趨勢。因此，不同時間點紋枯病菌含量的變化，驗證了紋枯病菌對水稻離體葉片組織的侵染。這種在精確控制的環(huán)境條件下檢測紋枯菌含量的方法，還可以用于水稻和紋枯病菌分子互作的研究。

本研究中對水稻離體葉片和大田水稻成株期葉片進(jìn)行紋枯病接種，取得了一致的試驗結(jié)果。對離體接種樣品紋枯菌的含量進(jìn)行qPCR檢測，具有簡便、精確等優(yōu)勢，適用于水稻與紋枯病菌互作研究。在水稻抗紋枯病種質(zhì)篩選過程中，建議先用離體葉片接種方法進(jìn)行初選，再結(jié)合大田水稻紋枯病接種試驗，對篩選材料進(jìn)行驗證，從而滿足大規(guī)模水稻種質(zhì)資源抗性篩選的需求。