抗白羽肉雞傳染性法氏囊病中草藥復(fù)方制劑的開發(fā)及應(yīng)用

黃亞東，黃 妍，竇如穎，薄洪峰

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.淮陰區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 淮安 223001）

雞傳染性法氏囊病 （infectious bursal disease，IBD）又稱雞傳染性腔上囊病，是由傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一種急性、接觸性、免疫抑制性傳染病，以法氏囊發(fā)炎、壞死、萎縮及法氏囊內(nèi)淋巴細(xì)胞嚴(yán)重受損為特征，易引起免疫機(jī)能障礙，干擾各種疫苗的免疫效果，該病的發(fā)病率、死亡率較高［1］。當(dāng)前，部分肉雞養(yǎng)殖企業(yè)及養(yǎng)殖戶為追求片面經(jīng)濟(jì)效益而濫用抗菌藥物和激素的現(xiàn)象比較嚴(yán)重，不僅造成雞體內(nèi)藥物殘留和蓄積，產(chǎn)生毒副作用，而且還會(huì)引起雞機(jī)體免疫力下降、病原菌耐藥性增強(qiáng)、雞肉品質(zhì)降低和環(huán)境污染等問題，甚至嚴(yán)重威脅人類健康［2］。根據(jù)雞傳染性法氏囊病的發(fā)病機(jī)理及中獸醫(yī)學(xué)理論，已有學(xué)者篩選出多味天然中草藥用于防治該病，這些藥物能促進(jìn)雞免疫器官發(fā)育，提高細(xì)胞免疫、體液免疫水平，刺激細(xì)胞因子產(chǎn)生，促進(jìn)肉雞生長發(fā)育，且不存在藥物殘留，不易產(chǎn)生抗藥性［3］。其作用機(jī)理是通過作用于下丘腦、垂體、腎上腺皮質(zhì)軸、環(huán)核苷酸系、植物神經(jīng)，提高T細(xì)胞數(shù)量，從而調(diào)節(jié)免疫功能［4］。該研究旨在通過評價(jià)不同中草藥復(fù)方制劑對白羽肉雞傳染性法氏囊病的預(yù)防和治療效果，以期為開發(fā)綠色、低毒、無殘留的雞傳染性法氏囊病防治藥物，有效降低由該病造成的經(jīng)濟(jì)損失提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：體重為18～22 g的小白鼠100只，由揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院提供；健康白羽肉雞5 600只，由江蘇省淮安市淮陰區(qū)龍?jiān)起B(yǎng)雞專業(yè)合作社提供。

1.1.2藥品及試劑：中草藥，購自淮安市淮陰區(qū)綠之康中藥材種植專業(yè)合作社，符合《中華人民共和國藥典》2000年版的中藥材標(biāo)準(zhǔn)；雞傳染性法氏囊血凝抑制試驗(yàn)抗原及陽性血清，購自哈爾濱動(dòng)物生物制品國家工程研究中心有限公司；雞傳染性法氏囊病病毒ELISA檢測試劑盒，購自南京金益伯生物股份有限公司；復(fù)合多維，購自河北遠(yuǎn)征動(dòng)物保健品有限公司。

1.1.3肉雞飼料：淮安市宏宇科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.4主要器材：臺式低速離心機(jī)（型號為TD6M），購自鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司；透反射偏光顯微鏡（型號為XPF-300），購自上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；氣旋式氣流粉碎分級機(jī) （型號為LHA-40）、混合機(jī)（型號為 LHH-200），購自濰坊正遠(yuǎn)粉體工程設(shè)備有限公司；PCR組織勻漿器（型號為04750-55），購自北京中科科爾儀器有限公司；注塑式飲水器（型號為YJ-F047），購自江蘇羽佳塑業(yè)有限公司；超聲波中藥專用霧化器（型號為KCW-6T），購自南通杰西電器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1中草藥篩選試驗(yàn)

1.2.1.1中草藥復(fù)方制劑配方：通過單味中草藥篩選，初步形成防治雞傳染性法氏囊病的6個(gè)中草藥處方。配方Ⅰ：由藿香、佩蘭、黃芪各11%，陳皮、生甘草、白茯苓、生白術(shù)各8%，厚樸、制半夏、白芷、蘇葉、防風(fēng)各7%組成。配方Ⅱ：由葛根18%，黃芩10%，黃連、蒲公英、馬齒莧、白頭翁、連翹各13%，生甘草7%組成。配方Ⅲ：由金銀花、蒲公英各22%，紫花地丁、野菊花各14%，連翹、桔梗、生甘草、蒼術(shù)各7%組成。配方Ⅳ：由白芍藥21%，黃芩、檳榔、當(dāng)歸各11%，大黃6%，肉桂、生甘草、木香各4%，無花果、蒲公英、生白術(shù)、黃連各7%組成。配方Ⅴ：由黃連、山梔各12%，蒲公英、馬齒莧、木香、金銀花各13%，黃芩、黃柏、生甘草各8%組成。配方Ⅵ：由白頭翁16%，黃柏、秦皮、車前草各10%，馬齒莧、玄參、無花果各11%，生甘草、陳皮、黃連各7%組成。配方Ⅰ～Ⅲ用于預(yù)防試驗(yàn)，配方Ⅳ～Ⅵ用于治療試驗(yàn)。

1.2.1.2藥理學(xué)試驗(yàn)：通過小白鼠飼喂試驗(yàn)、Ea花環(huán)形成率測定、EAC花環(huán)形成率測定、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率測定、中性粒細(xì)胞功能測定、紅細(xì)胞免疫功能測定等藥理學(xué)試驗(yàn)，確認(rèn)中草藥復(fù)方制劑對肉雞免疫功能具有促進(jìn)作用［5-6］。

1.2.1.3毒理學(xué)試驗(yàn)：通過小鼠急性毒性試驗(yàn)、微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)，確認(rèn)中草藥復(fù)方制劑對小鼠無毒副作用、致變作用、生殖毒性［7］。

1.2.2預(yù)防試驗(yàn)：選取2 800羽白羽肉雞，飼養(yǎng)全程采用相同的肉雞飼料，且不添加任何抗生素。利用3種預(yù)防中草藥復(fù)方制劑（配方Ⅰ～Ⅲ），采用拌料給藥、飲水給藥、霧化給藥及綜合預(yù)防4種方法開展預(yù)防試驗(yàn)，每種試驗(yàn)方法均設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組和2個(gè)對照組。免疫程序如下：4～5日齡時(shí)，肌肉注射腎型雞傳染性支氣管炎油乳劑滅活苗0.25 mL；7～9日齡時(shí)，采用雞新城疫Ⅳ系苗+傳染性支氣管炎H120二聯(lián)苗點(diǎn)眼、滴鼻各1次；14～16日齡時(shí)，采用雞傳染性法氏囊中毒苗一倍量飲水或凍干弱毒苗雙倍量飲水；20～22日齡時(shí)，皮下注射禽流感疫苗；26～28日齡時(shí)，采用雞傳染性法氏囊中毒苗雙倍量飲水；31～33日齡時(shí)，采用雞新城疫Ⅳ系苗雙倍量飲水。在免疫前后，使用復(fù)合多維飲水以減少應(yīng)激反應(yīng)。4種方法中的試驗(yàn)組雞群均按照上述免疫程序免疫，但不進(jìn)行雞傳染性法氏囊疫苗免疫；每種試驗(yàn)方法中的對照1組按照上述免疫程序免疫，對照2組不采取任何免疫措施。4種試驗(yàn)方法中，雞群均自由采食和飲水，飼喂時(shí)間均為42 d。

1.2.2.1拌料給藥預(yù)防試驗(yàn)：3種預(yù)防方劑粉碎后過篩，試驗(yàn)1組飼喂方劑Ⅰ，試驗(yàn)2組飼喂方劑Ⅱ，試驗(yàn)3組飼喂方劑Ⅲ，添加量均為1%。

1.2.2.2飲水給藥預(yù)防試驗(yàn)：將預(yù)防方劑粉碎后按1 kg藥材加10 L水的比例，浸泡3 h，煮沸后繼續(xù)用文火熬煮1 h，壓榨后取湯汁。試驗(yàn)1組飼喂方劑Ⅰ，試驗(yàn)2組飼喂方劑Ⅱ，試驗(yàn)3組飼喂方劑Ⅲ，每日8：00禁水2 h后飲水給藥1次。

1.2.2.3霧化給藥預(yù)防試驗(yàn)：將預(yù)防方劑粉碎后按1 kg藥材加10 L水的比例，浸泡3 h，煮沸后繼續(xù)用文火熬煮1 h，壓榨后取湯汁，放入霧化器中。試驗(yàn)1組采用方劑Ⅰ，試驗(yàn)2組采用方劑Ⅱ，試驗(yàn)3組采用方劑Ⅲ，每日8：00霧化1次，霧化時(shí)間30 min。

1.2.2.4綜合預(yù)防試驗(yàn)：試驗(yàn)1組利用方劑Ⅰ，試驗(yàn)2組利用方劑Ⅱ，試驗(yàn)3組利用方劑Ⅲ。每日按1%劑量拌料飼喂；8：00霧化1次，霧化時(shí)間30min；同時(shí)禁水2 h后飲水給藥1次。

1.2.2.5預(yù)防效果評價(jià)指標(biāo)：飼喂試驗(yàn)期間，觀察并記錄4種預(yù)防試驗(yàn)方法中各試驗(yàn)組和對照組肉雞的發(fā)病和死亡情況，計(jì)算各組發(fā)病率和死亡率。飼喂試驗(yàn)結(jié)束后，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較同一種方法中各組肉雞的發(fā)病率和死亡率之間的差異。

1.2.3治療試驗(yàn)：將IBDV按1∶4的比例制成懸濁液，對2 800只白羽肉雞滴鼻、點(diǎn)眼，每只雞0.05 mL，攻毒24～36 h后，當(dāng)雞群出現(xiàn)精神委頓、食欲下降等癥狀時(shí)，進(jìn)行分組試驗(yàn)。利用3種治療中草藥復(fù)方制劑（配方Ⅳ～Ⅵ），采用拌料給藥、飲水給藥、霧化給藥及綜合治療4種方法開展治療試驗(yàn)，每種試驗(yàn)方法均設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組和2個(gè)對照組。4種方法中的試驗(yàn)組雞群按照上述4種方法進(jìn)行治療；對于每種方法中的2個(gè)對照組，對照1組使用抗生素+抗病毒藥物飲水的方法進(jìn)行對癥治療，持續(xù)給藥至病雞全部康復(fù)，對照2組不采取任何治療措施。4種試驗(yàn)方法中，雞群均自由采食和飲水，飼喂時(shí)間均為42 d。

1.2.3.1拌料給藥治療試驗(yàn)：3種治療方劑粉碎后過篩，試驗(yàn)1組飼喂方劑Ⅳ，試驗(yàn)2組飼喂方劑Ⅴ，試驗(yàn)3組飼喂方劑Ⅵ，添加量均為1%。

1.2.3.2飲水給藥治療試驗(yàn)：將治療方劑粉碎后按1 kg藥材加10 L水的比例，浸泡3 h，煮沸后繼續(xù)用小火熬煮1 h，壓榨后取湯汁。試驗(yàn)1組采用方劑Ⅳ，試驗(yàn)2組采用方劑Ⅴ，試驗(yàn)3組采用方劑Ⅵ，每日分別于8：00和20：00禁水1 h后飲水給藥1次，持續(xù)給藥7 d。

1.2.3.3霧化給藥治療試驗(yàn)：將治療方劑粉碎后按1 kg藥材加10 L水的比例，浸泡3 h，煮沸后小火熬煮1 h，壓榨后取湯汁，放入霧化器中。試驗(yàn)1組采用方劑Ⅳ，試驗(yàn)2組采用方劑Ⅴ，試驗(yàn)3組采用方劑Ⅵ，每日分別于8：00和20：00各霧化1次。

1.2.3.4綜合治療試驗(yàn)：試驗(yàn)1組采用方劑Ⅳ，試驗(yàn)2組采用方劑Ⅴ，試驗(yàn)3組采用方劑Ⅵ。每日按1%劑量拌料飼喂給藥；將方劑制成湯劑進(jìn)行飲水給藥；每日8：00和20：00霧化給藥各1次。

1.2.3.5治療效果評價(jià)指標(biāo)：飼喂試驗(yàn)期間，觀察并記錄4種治療試驗(yàn)方法中各試驗(yàn)組和對照組肉雞的治愈和死亡情況，計(jì)算各組治愈率和死亡率。飼喂試驗(yàn)結(jié)束后，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較同一種方法中各組肉雞的治愈率和死亡率之間的差異。

1.2.4雞傳染性法氏囊病診斷方法

1.2.4.1臨床癥狀：精神不振，食欲廢絕，畏寒發(fā)抖，扎堆，閉目嗜睡，垂翅。排白色水樣糞便，泄殖腔周圍羽毛被糞便污染，下痢失水，伴有呼吸道癥狀。發(fā)病后1～2 d病雞增多并發(fā)生死亡，4～5 d達(dá)死亡高峰。

1.2.4.2病理解剖特征：脫水，皮下肌肉干澀，兩側(cè)股部小腿部肌肉色澤灰暗，胸肌、腿肌有塊狀出血，嚴(yán)重者整個(gè)腿肌呈紅布樣出血。腺胃和肌胃交界處有出血帶或出血斑點(diǎn)，肝腎腫大，實(shí)質(zhì)脆弱，脂肪變質(zhì)，顏色較淡，有尿酸鹽沉積使腎呈現(xiàn)花斑狀。法氏囊充血、水腫，體積增大2～3倍，外表被覆黃色膠凍樣液體，切開后黏膜皺褶渾濁不清，表面有點(diǎn)狀出血或彌漫性出血［5］。

1.2.4.3血清學(xué)診斷：取病死雞腫脹和有出血點(diǎn)的法氏囊組織，按1∶5的比例加入pH值為7.2的PBS溶液，用組織勻漿器制備混懸液，反復(fù)凍融，4 000 r/min離心10 min，以上清液待檢抗原與標(biāo)準(zhǔn)陽性IBDV血清做瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)。若法氏囊組織與IBDV陽性血清出現(xiàn)清楚的沉淀線，則判定為陽性。

1.2.4.4雞傳染性法氏囊病病毒ELISA試劑盒檢測：將棉簽插入泄殖腔中刮取內(nèi)容物，置于保存液中，用ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測，若為陽性則確診為IBD。

表1 拌料給藥預(yù)防效果 %

表2 飲水給藥預(yù)防效果 %

表3 霧化給藥預(yù)防效果 %

1.2.4.5PCR 診斷［8］：人工接種 IBDV，間隔不同時(shí)間采集雞法氏囊、胸腺、脾、盲腸、扁桃體、腎、肝和腿肌組織樣本進(jìn)行RT-PCR檢測，同時(shí)觀察各組織的病理變化。接種4 h后，肝、腎、脾等組織即出現(xiàn)明顯的陽性信號，即診斷為IBDV感染?；蜻x取IBDV的高度保守序列進(jìn)行PCR檢測，取病死雞的法氏囊，剪碎，研磨，提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用國際動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）已發(fā)表的相關(guān)引物 （上游引物序列：5′-TGTAAAACGACGGCCAGTGCATGCGGTATGTGAGGCTTGGTGAC-3′，下游引物序列：5′-CAGGAAACAGCTATGACCGAATTCGATCCTGTTGCCACTCTTTC-3′） 進(jìn) 行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，目的片段大小為604 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)防效果

2.1.1拌料給藥預(yù)防效果：由表1可知，在拌料給藥預(yù)防試驗(yàn)中，試驗(yàn)2組肉雞的發(fā)病率顯著低于試驗(yàn)1組、試驗(yàn) 3組和對照1組（P＜0.05），試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組肉雞的發(fā)病率與對照1組相比差異不顯著（P＞0.05），對照2組肉雞的發(fā)病率極顯著高于其他4組（P＜0.01）；試驗(yàn)2組肉雞的死亡率顯著低于試驗(yàn)1組、試驗(yàn)3組（P＜0.05），試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組肉雞的死亡率顯著高于對照1組 （P＜0.05），對照2組肉雞的死亡率極顯著高于其他4組（P＜0.01）。

表4 綜合預(yù)防試驗(yàn)效果 %

2.1.2飲水給藥預(yù)防效果：由表2可知，在飲水給藥預(yù)防試驗(yàn)中，3個(gè)試驗(yàn)組肉雞的發(fā)病率與對照1組相比差異不顯著（P＞0.05），對照2組肉雞的發(fā)病率極顯著高于其他4組（P＜0.01）；試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組肉雞的死亡率顯著低于對照1組 （P＜0.05），試驗(yàn)2組肉雞的死亡率極顯著低于試驗(yàn)1組、試驗(yàn)3組和對照1組（P＜0.01），對照 2組肉雞的死亡率極顯著高于其他4組（P＜0.01）。

2.1.3霧化給藥預(yù)防效果：由表3可知，在霧化給藥預(yù)防試驗(yàn)中，3個(gè)試驗(yàn)組肉雞的發(fā)病率與對照1組相比差異不顯著（P＞0.05），對照2組肉雞的發(fā)病率極顯著高于其他4組（P＜0.01）；試驗(yàn)1組肉雞的死亡率顯著低于對照1組 （P＜0.05），試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組肉雞的死亡率極顯著高于試驗(yàn)1組和對照1組（P＜0.01），對照2組肉雞的死亡率極顯著高于其他 4 組（P＜0.01）。

2.1.4綜合預(yù)防試驗(yàn)效果：由表4可知，在綜合預(yù)防試驗(yàn)中，3個(gè)試驗(yàn)組肉雞的發(fā)病率與對照1組相比差異不顯著（P＞0.05），對照2組肉雞的發(fā)病率極顯著高于其他4組（P＜0.01）；試驗(yàn)2組肉雞的死亡率極顯著低于試驗(yàn)1組、試驗(yàn)3組和對照1組（P＜0.01），試驗(yàn)1組肉雞的死亡率極顯著高于試驗(yàn)3組和對照1組（P＜0.01），試驗(yàn)3組肉雞的死亡率與對照1組相比差異不顯著（P＞0.05），對照2組肉雞的死亡率極顯著高于其他4組（P＜0.01）。

2.2 治療效果

2.2.1拌料給藥治療效果：由表5可知，在拌料給藥治療試驗(yàn)中，3個(gè)試驗(yàn)組肉雞的治愈率與對照2組相比差異不顯著（P＞0.05），對照組1肉雞的治愈率極顯著高于其他4組（P＜0.01）。

表5 拌料給藥治療效果 %

表6 飲水給藥治療效果 %

表7 霧化給藥治療效果 %

表8 綜合治療試驗(yàn)效果 %

2.2.2飲水給藥治療效果：由表6可知，在飲水給藥治療試驗(yàn)中，3個(gè)試驗(yàn)組肉雞的治愈率極顯著高于對照2組（P＜0.01），試驗(yàn)1組和試驗(yàn) 2組肉雞的治愈率與對照1組相比差異不顯著 （P＞0.05），試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組肉雞的治愈率極顯著高于試驗(yàn)3組（P＜0.01），試驗(yàn)3組肉雞的治愈率極顯著低于對照 1組（P＜0.01）。

2.2.3霧化給藥治療效果：由表7可知，在霧化給藥治療試驗(yàn)中，3個(gè)試驗(yàn)組肉雞的治愈率極顯著低于對照1組（P＜0.01），試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組肉雞的治愈率極顯著高于對照2組（P＜0.01），試驗(yàn)3組肉雞的治愈率與對照2組差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.4綜合治療效果：由表8可知，在綜合治療試驗(yàn)中，3個(gè)試驗(yàn)組肉雞的治愈率極顯著高于對照2組（P＜0.01）；試驗(yàn)1組和試驗(yàn)2組肉雞的治愈率與對照1組差異不顯著（P＞0.05），但顯著高于試驗(yàn)3組（P＜0.05）；試驗(yàn)3組肉雞的治愈率顯著低于對照 1 組（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

在預(yù)防試驗(yàn)中，試驗(yàn)組肉雞均出現(xiàn)IBDV感染情況，但配方Ⅱ的綜合預(yù)防效果優(yōu)于其他2個(gè)配方。雖然對照組雞群進(jìn)行了IBD免疫，但仍可檢出陽性病例，分析原因有2種可能：一是法氏囊疫苗保護(hù)率低，二是病雞感染其他病原后機(jī)體抵抗力減弱，被法氏囊病毒再次感染。

在治療試驗(yàn)中，配方Ⅴ的綜合治療效果最佳，可代替或部分代替抗生素及抗病毒藥物，為最佳治療配方。飲水給藥治療和綜合治療方法的效果明顯優(yōu)于拌料給藥治療和霧化給藥治療方法，后兩者的治療效果不佳可能與肉雞發(fā)病后采食量下降、呼吸不暢，不能攝入足夠的藥量有關(guān)。

該研究結(jié)果表明，天然中草藥復(fù)方制劑具有一定的預(yù)防和治療肉雞傳染性法氏囊病的功效。