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目前，在國(guó)內(nèi)研究狂犬病的主要對(duì)象是狗和人類，而較少對(duì)野生動(dòng)物進(jìn)行研究。然而，近年來(lái)，狂犬病病毒(RABV)也已從其他野生動(dòng)物中分離出來(lái)，包括貓、狼、狐貍、大鼠、蝙蝠和家畜，牛、豬、羊和梅花鹿等[1-3]。早在1991年初，在我國(guó)內(nèi)蒙古突泉縣[4]，狼突然襲擊了一個(gè)村子，咬傷了人，牛和馬。與此同時(shí)，在村里發(fā)現(xiàn)許多不明原因的狐貍死亡。在2002和2008，許多類似的案件也發(fā)生在我國(guó)浙江省淳安縣和周邊地區(qū)，隨后研究人員從被鼬獾咬傷后死亡的家養(yǎng)動(dòng)物(狗、貓、豬)中得到狂犬病病毒的全序列[5-6]，同時(shí)，在2007，研究人員從內(nèi)蒙古浣熊狗和紅狐身上分離出狂犬病病毒[7]，2012，韓國(guó)科學(xué)家在家養(yǎng)的動(dòng)物(狗和貓)和野生動(dòng)物(浣熊狗)中檢測(cè)到狂犬病病毒[8]。自1986以來(lái)，我省根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料和臨床診斷結(jié)果，20余只家畜在被感染犬或狼咬傷后感染了狂犬病，但是由于實(shí)驗(yàn)條件有限，研究人員沒(méi)有得到實(shí)驗(yàn)室資料直到2012和2014年，我們發(fā)現(xiàn)在青海省果洛藏族自治州和玉樹(shù)藏族族自治州發(fā)生了類似狼傷人和家畜事件，因此，我們開(kāi)始收集狗、牦牛脊髓和人類血清和唾液標(biāo)本的腦組織。對(duì)核酸片段進(jìn)行測(cè)序并比較和分析，建立分子進(jìn)化樹(shù)，以確定感染的來(lái)源和傳播途徑。

1 材料與方法

1.1收集不同來(lái)源的組織樣本 2012—2016年我們從青海省不同地區(qū)共收集了194個(gè)樣本，包括果洛州、玉樹(shù)州、黃南州、海北州、海西州、海南州、海東市。樣本包括1例患者血清標(biāo)本，5人唾液，3只牦牛骨髓，和8只狼和其他動(dòng)物樣本的腦組織(2只貓，1只蝙蝠和3只狐貍)，其余142個(gè)樣本由3種犬的腦組織組成(見(jiàn)表1)，第1種是有狂犬病的病犬，有咬傷的人和牦牛，第2種是犬被野狼或狂犬病咬傷，第3種犬是流浪犬或垂死的犬(活的動(dòng)物是以安樂(lè)死的方式處死，死去的動(dòng)物是取尸體)。

1.2直接免疫熒光法檢測(cè)狂犬病病毒 取腦組織或脊髓，均勻的涂印在載玻片上(使用前，將玻璃浸泡在無(wú)水酒精中30 min)制成組織壓印片，用丙酮固定10 min，加入狂犬病病毒熒光素標(biāo)記的抗RABV-N單克隆(Japanese，Chemicon company)和伊文斯藍(lán)染料在壓片上，在37 ℃下孵育30 min后，用PBS液洗滌3次，吹干。用90%甘油封閉片，在熒光顯微鏡下，可見(jiàn)針尖大小，點(diǎn)狀，發(fā)綠色熒光的顆粒，疑似高爾基體體(Negri小體)和病毒顆粒[9]。

表1 不同動(dòng)物樣品的組成
Tab.1 The composition of different animals sample

動(dòng)物類型樣本數(shù)(只)DFA陽(yáng)性數(shù)全序列數(shù)犬142305狼831牦牛321人531貓200蝙蝠100狐貍300

1.3核酸提取與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 用TRIzol 法(Ambion, USA)[10-11]從腦組織和脊髓中提取總RNA。Oligo-dT (TaKaRa, Japan)作為一個(gè)隨機(jī)引物，用Ready-To-GoTMYou-Prime First-Strand Beads kit (GE Healthcare, UK)為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)mRNA進(jìn)行第一鏈cDNA的合成。

1.4PCR引物 通過(guò)參照NCBI庫(kù)中8個(gè)毒株(AY956319.1, AF499686.2, EF437215.1, HE802676.1, HQ450386.1, KC171645.1, KF155000.1, NC001542.1)的基因組保守區(qū)序列設(shè)計(jì)了7對(duì)外引物和7對(duì)內(nèi)引物(見(jiàn)表2)，由上海生物工程有限公司合成。

1.5PCR 擴(kuò)增 用合成的cDNA為模板，用GoTaq Green Master Mix Kit (Promega, USA)對(duì)7對(duì)外引物和7對(duì)內(nèi)引物片段進(jìn)行擴(kuò)增，巢式PCR條件[12]如下：第1次擴(kuò)增：94 ℃，預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min 40 s，共34個(gè)循環(huán)。第2次擴(kuò)增為94 ℃，預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 ℃，56 ℃ 40秒，72 ℃ 30 ℃，35次循環(huán)，72 ℃ 10 min，用1.5%瓊脂糖凝膠120 V，30 min電泳，用TaKaRa (100 bp-2 000 bpDNA)Markers進(jìn)行鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。如果樣本顯示陽(yáng)性條帶，將其切下用于下一步的實(shí)驗(yàn)。

表2 本文中使用的引物序列
Tab.2 Primer reference sequences used in this study

命名引物序列核苷酸數(shù)退火溫度位點(diǎn)長(zhǎng)度1rabiesF1acgcttaaca acaagatcaa agaagaa2762.71rabiesR1ccctggag(A)gg ttaggaaagt tgac2464.519271927rabiesR2ttgtctgact atctggactc caacatt2762.718341834rabiesF3gaagataatc aggctcatct ccagg2562.716101rabiesR3gatgtcccca gtctcggatt ctc2363.739402331rabiesF4caagtatcga gaagactttc agatggat2863.21738rabiesR4atatctgggg tcaccggcca t2165.037011964rabiesF5ggg(A)aaattcc ccatctacac gatac2564.33375rabiesR5tg(A)gaacaatt g(A)tctgtcagg gtcat2564.556242250rabiesF6tcc(T)tacatgg aacttaaagt gggataca2864.13501rabiesR6tagtca(G)gaat tcctcaa(G)gat gttggg2563.155202020rabiesF7tgaaggacat aagcaatagc ttacaatca2964.55260rabiesR7c(T)ccgatgagg tctgatct(G)gt ctga2465.174232164rabiesF8gtacataatt ataaagggct gggtcatct2963.65308rabiesR8tcctct(C)gtt(C)g actccaatct(G) ttgatg2668.873112004rabiesF9gacttgataa ttggtcttaa accaaagga2964.47016rabiesR9ccgtatatgt tgacaggg(A)aa gatggt2664.896452063rabiesF10tggccaacta catcctgcca(C) ctt(C)t2466.87128rabiesR10gccactaaga tt(C)gaatataa gagcccct2865.595912464rabiesF11catgtttcag ccattgatgc tttatg2665.19262rabiesR11ctctc(T)tgcat ctcactcttt(C) ggg(A)ct2565.4111411880rabiesF12agaatatcta gaatggtttc tggagct(G)gt2963.59440rabiesR12gctacaattg aacaacacaa ggctcat2765.2111161677rabiesF13agtgatagat tttgactcca tctggga2763.910684rabiesF14cagaagttac tgacatc(T)gca tctatcaa2863.5108061123rabiesR14acgcttaaca aataaacaag aaagataaaa a3163.5119281245

1.6cDNA測(cè)序 MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0 (TaKaRa) 試劑用于熔化和純化切下的含DNA片段的瓊脂糖，用得到純化DNA作為模板，用BigDye Terminator v. 3.1 kit (Applied Biosystems, USA)進(jìn)行了測(cè)序反應(yīng)擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段通過(guò)Performa DTR Gel Filtration Cartridges kit (EdgeBio, USA)進(jìn)行純化，(上述實(shí)驗(yàn)參照試劑盒說(shuō)明書(shū))，用ABI 3500基因分析儀進(jìn)行序列測(cè)序。

1.7序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 用ATGC軟件 (GenetyxCo. Tokyo, Japan)校準(zhǔn)測(cè)序的序列片段，用DNAstar (5.01 version, Laser gene,USA)軟件用來(lái)拼接序列，The Clustal X 軟件[13]用來(lái)進(jìn)行全序列比對(duì)，用Mega 2軟件包中的The Neighbor Joining(NJ)法[14]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并用1000個(gè)Bootstrap(BP)復(fù)制方法估計(jì)bootstrap neighbor-joinin tree 的可靠性。

2 結(jié) 果

2.1狂犬病病毒抗原檢測(cè) 在2012—2016年間，我們從青海省玉樹(shù)、黃南、果洛、海北、海西、海東市等地獲得了194個(gè)動(dòng)物腦組織標(biāo)本，其中有牦牛骨髓、家犬腦組織和自然死亡狼腦組織標(biāo)本等均用于制成組織壓印片。在熒光顯微鏡下，我們觀察到不同大小帶熒光的點(diǎn)和點(diǎn)狀物，見(jiàn)(圖1)，從這194種不同的動(dòng)物獲得38個(gè)DFA陽(yáng)性結(jié)果。

(a)狂犬病病毒抗原陰性犬腦組織；(b)狂犬病病毒抗原陽(yáng)性的2014狼腦組織；(c)狂犬病病毒抗原陽(yáng)性2014年牦牛脊髓；(d)狂犬病病毒抗原陽(yáng)性2014犬腦組織圖1 直接免疫熒光法(抗狂犬病病毒N單克隆抗體)檢測(cè)狂犬病毒核蛋白抗原Fig.1 Detection of rabies virus nucleoprotein antigens by direct immunofluorescent assay with anti-rabies virus N monclonal antibody

2.2流行病學(xué)分析 在2012和2016年間，分別在青海省果洛藏族自治州瑪多縣扎陵湖和鄂陵湖附近，家犬和羊群被狼咬傷后不明原因死亡，同時(shí)，兩主人被自家的犬咬傷繼而感染了狂犬病而死亡，2014年，青海玉樹(shù)藏族自治州稱多縣仲達(dá)鄉(xiāng)和拉卜鄉(xiāng)，發(fā)生了許多類似的疫情，因?yàn)槔且?，犬感染狂犬病后咬傷牦牛和羊，同時(shí)，人們?cè)诖謇锇l(fā)現(xiàn)了野狼的尸體。在4年的時(shí)間里，我們得到了38個(gè)陽(yáng)性樣本，它們主要分布在玉樹(shù)和果洛藏族自治州(見(jiàn)圖2)，在海北州或西寧地區(qū)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣本，大部分DFA陽(yáng)性標(biāo)本分布在青海省西部和南部，而且DFA陽(yáng)性樣品的分布趨勢(shì)是由西向東遞減。在相鄰的省份西藏和甘肅，在2012年和2013年，也有狂犬病發(fā)生的報(bào)告，但是對(duì)于2013年來(lái)自甘肅的CGS1301D.GS株，屬于 China I 型[15]，它與青海得到的序列不是相同的基因型別。根據(jù)流行病學(xué)區(qū)域分布數(shù)據(jù)，青海省狂犬病病毒的傳播途徑為西向東。在時(shí)間分布上，陽(yáng)性率主要在2014和2015年，陽(yáng)性樣品26個(gè)，占總陽(yáng)性樣品的68.42%，2016年開(kāi)始的陽(yáng)性病例在減少，主要是因?yàn)槲沂∧羺^(qū)開(kāi)展家養(yǎng)犬定期接種疫苗和對(duì)瘋狗捕殺的工作。

圖2 青海地區(qū)DFA陽(yáng)性數(shù)和樣本的區(qū)域分布圖Fig.2 The regional distribution of DFA-positive case and samples in Qinghai province

2.3核酸序列分析 通過(guò)對(duì)38個(gè)DFA陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行核酸序列片段的擴(kuò)增和測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)軟件將序列直接連接在一起，最終獲得8個(gè)全長(zhǎng)基因組的核酸序列，(其余的樣品由于核酸濃度較低，未測(cè)序成功)。這8個(gè)核苷酸序列提交到GenBank后得到的登錄號(hào)為：(KY982923、KY99752、KY982922、KY912036、KY952220、KY952219、KY964 323和KY964 322)?？袢〔《镜幕蚴堑湫突蚪M結(jié)構(gòu)，它由N-P- G-G-L片段組成，第一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼核蛋白(NP)開(kāi)始于75(CQHY2014W)，76(CQHM2016D，CQHY2014D150，CQHY2016D)，78(CQHY2014Y)和79(CQHM2012-，CQHY2014D-Y，CQHM2016H)位氨基酸，長(zhǎng)度為1 350 bp，編碼區(qū)起始于ATG密碼，終止于TAA或TGA；PP143-148具有高度保守的DKSTQT結(jié)構(gòu)域，保證和Dynin相互作用。在細(xì)胞質(zhì)中，在含有結(jié)構(gòu)脯氨酸PPEY的MP 45-48中，確保功能基的結(jié)構(gòu)不改變；55-58 NLS的GP糖基化位點(diǎn)，265-267的DET，33 3-335 KVS，35-340的NKT，通過(guò)分析，我們發(fā)現(xiàn)這8個(gè)核苷酸序列中相似性和我們實(shí)驗(yàn)室在2012年提交的序列CQH2012D(KM27 2192.1)的相似性在95%-100%，在序列結(jié)構(gòu)上沒(méi)有差異(見(jiàn)表3)。

表3 狂犬病全序列標(biāo)本基本情況
Tab.3 The basic situation of whole sequence rabies specimen

實(shí)驗(yàn)室編號(hào)宿主樣品類型樣品編號(hào)時(shí)間收錄號(hào)其他2012humanghumansurmerCQHM2012H2012.12KY982923Bitten by dog2014dog-YakdogbrainCQHY2014D-Y2014.4KY997452dog-Yak2014Yakcattlespinal cordCQHY2014Y2014.4KY9829222014dog-150dogbrainCQHY2014D1502014.10KY9120362014wolfwolfbrainCQHY2014W2014.11KY952220Natural death2016dogdogbrainCQHM2016D2016.11KY952219Dog-human2016humanhumansalivaCQHM2016H2016.11KY964323Bitten by dog2016ysdogdogbrainCQHY2016D2016.6KY964322

2.4核苷酸序列的進(jìn)化分析 我們比較了8株狂犬病病毒開(kāi)放閱讀框(ORF)的G基因和N基因核苷酸序列與來(lái)自GenBank中的中國(guó)和世界各地35株N基因和38株G基因序列，構(gòu)建NJ(NJ，復(fù)制= 1000)進(jìn)化樹(shù)，但N基因和G基因的結(jié)果相同。本研究以8個(gè)N基因序列和分別來(lái)自我省2012年的CQH2012D株(KM27 2192.1)和來(lái)自西藏的2012年的CXZ1201D犬(KC46352)株，它們形成一個(gè)獨(dú)立的分支(圖3)。按照中國(guó)狂犬病病毒分成6個(gè)主要基因型(China I-China VI)[15-16]作為參考，我們得到的8個(gè)核苷酸序列屬于China Ⅳ，與Arctic-like2類病毒高度相關(guān)，其中包括2008年在內(nèi)蒙古分離的neimeng925(FJ415313)和neimeng1025b(EU652445)，這些分離株具有非常密切的親緣關(guān)系，他們和在中國(guó)其他流行地區(qū)分離到的基因型別(Ⅰ-Ⅱ)[9]有很大的區(qū)別，(見(jiàn)圖3)。雖然我們沒(méi)有足夠的證據(jù)發(fā)現(xiàn)我國(guó)有獨(dú)立持續(xù)存在野生動(dòng)物中的狂犬病，以前的研究表明所有的結(jié)果都是狼的狂犬病是從狗溢出引起的[7]。然而，根據(jù)序列的相似性和流行病學(xué)的數(shù)據(jù)分析，表明狂犬病毒在中國(guó)青藏高原地區(qū)的傳播途徑是家養(yǎng)動(dòng)物和人被野生狼或瘋?cè)蟀l(fā)病。

“紅點(diǎn)”是青海省疾病預(yù)防控制中心提交序列，“綠點(diǎn)”是中國(guó)疾病預(yù)防控制中心提交序列。圖3 基于中國(guó)狂犬病病毒和世界其他國(guó)家狂犬病病毒N基因開(kāi)放閱讀框(ORF)核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree base on the open reading frame(ORF) nucleotide sequences of the N geneof Chinese rabies viruses and those from other countrie in the world

3 討 論

在我國(guó)狂犬病病例的報(bào)道中大多數(shù)是犬類，相對(duì)較少發(fā)生在牛中[17]。然而，在我國(guó)牛的狂犬病也有少量報(bào)道，曾發(fā)生在新疆和河南省[18-19]。近年來(lái)，韓國(guó)和其他地方有狂犬病發(fā)生在家養(yǎng)動(dòng)物和野生動(dòng)物上的報(bào)道[20-22]，在我們的研究中，在青海省的人和不同動(dòng)物組織樣品(牦牛、狼、狗)中檢測(cè)到狂犬病病毒。在我們此次的調(diào)查中表明狂犬病可以從被野狼咬傷的家養(yǎng)狗傳播給家養(yǎng)的牦牛和人，通過(guò)青?？袢∽罱餍汹厔?shì)表明，野生的狼可以在中國(guó)西北傳播狂犬病。

在中國(guó)狂犬病的基因型中，目前ChinaⅠ型為優(yōu)勢(shì)型別，其中80%分布在19個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)，ChinaⅡ型遍及全國(guó)7個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)。然而，中國(guó)的Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ組相對(duì)發(fā)生率較低，其分布區(qū)域相對(duì)有限[9]，我們對(duì)本研究獲得的8個(gè)核酸序列進(jìn)行了G、N基因核苷酸序列的同源性和進(jìn)化分析，比較他們與西藏犬XZ1(2012)與和蒙古野生動(dòng)物的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了同屬于Arctic-like 群，該群主要分布在世界的北極地區(qū)，以及亞洲西部、俄羅斯、內(nèi)蒙古、韓國(guó)等國(guó)家和地區(qū)，并在野生動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)[18]，我們此次從青藏高原地區(qū)的家畜和野生動(dòng)物中分離出 Arctic-like2病毒。他們都屬于中國(guó)Ⅳ組。I. V. Kuzmin在他的研究[23]表明喜馬拉雅山脈和西藏的山區(qū)可能是野生動(dòng)物中病毒種群的自然屏障，但我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)的證據(jù)表明狂犬病可以打破這種自然屏障。我們所獲得的序列和2012年從CXZ1201d(KC465372)序列高度相似，這一結(jié)果表明Arctic-like2病毒分布在中國(guó)的西北部青藏高原地區(qū)。此外，由青海病毒陽(yáng)性的地區(qū)分布表明，提示青海由西向東傳播狂犬病的趨勢(shì)與野生動(dòng)物由西向東的遷移可能有一定關(guān)系。

青海位于中國(guó)西北部的青海西藏高原、果洛藏族自治州和玉樹(shù)藏族自治州位于青海省南部，與玉樹(shù)與西藏、四川、新疆和其他省份接壤。本研究中，38個(gè)陽(yáng)性樣品主要分布在玉樹(shù)州稱多縣和果洛州瑪多縣扎陵湖和嶺湖，牦牛是青海-西藏高原上較為常見(jiàn)和優(yōu)質(zhì)的家畜，由于其對(duì)青海惡劣生態(tài)條件的適應(yīng)性強(qiáng)，高山草場(chǎng)和雪地是這些草畜不可缺少的，牦牛在天然草地上放養(yǎng)，使它們易受野生動(dòng)物傷害。牧民靠放牧牦牛和羊群為生，犬被用來(lái)保護(hù)主人和家畜。當(dāng)狼攜帶狂犬病并咬傷家畜，如犬時(shí)，犬會(huì)攜帶狂犬病，那么主人也會(huì)被狗咬傷后死于狂犬病。在青藏高原上有許多野生動(dòng)物，主要包括狼、紅狐、棕熊、雪豹、土撥鼠等。2009年，約翰遜[24]在土耳其發(fā)現(xiàn)狐貍、牛、貓、松鼠和其他野生動(dòng)物的狂犬病。2015年中國(guó)畜牧業(yè)發(fā)表的一項(xiàng)研究指出，在我國(guó)北方浣熊狗可以傳播Arctic-like狂犬病病毒給人和動(dòng)物。最近的研究表明，其他野生動(dòng)物(田鼠、狐貍和蝙蝠)也能傳播狂犬病病毒[25]，在我們的研究中，我們收集了貓、狐貍和蝙蝠的樣本，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性標(biāo)本。這些結(jié)果表明，我們應(yīng)該加強(qiáng)在中國(guó)西北地區(qū)狂犬病的研究和密切關(guān)注其他病毒基因型的傳播。

(致謝：作者在盧茁壯博士的指導(dǎo)和幫助下完成了所有的實(shí)驗(yàn)室工作和引物設(shè)計(jì)。盧茁壯博士來(lái)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心，擔(dān)任青海項(xiàng)目官員的國(guó)家顧問(wèn)。他在我們實(shí)驗(yàn)室工作了一年，參與和指導(dǎo)我們的實(shí)驗(yàn)市工作。此外，我們還得到了我省的州、縣疾病預(yù)防控制中心在樣本采樣和流行病調(diào)查工作的支持，在此一并致謝！)