超聲波輔助水蒸氣提取檸檬精油工藝優(yōu)化及成分分析

肖 娟 周 康 胡 濱 蘇 趙

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014)

檸檬屬蕓香科常綠小喬木，果實(shí)為淡黃色柑橘類水果，原產(chǎn)于馬來西亞、北非、中國等多個國家，在全世界廣泛種植。近年來，中國檸檬種植面積不斷增加，除直接銷售鮮果外，檸檬加工產(chǎn)品的類別也逐漸豐富，如檸檬果醋、檸檬果酒等。由于檸檬產(chǎn)品在加工時會產(chǎn)生大量的皮、渣等廢棄物，而檸檬皮中含有豐富的香精油[1]。香精油因其獨(dú)特的清香和良好防腐抗菌性能，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、香精香料以及醫(yī)藥等領(lǐng)域[2]。因此，提高檸檬加工廢棄物的綜合開發(fā)利用，對提高檸檬加工產(chǎn)品附加值具有重要意義。

目前，有關(guān)檸檬精油的提取方法已有壓榨法、有機(jī)溶劑提取法、超臨界流體萃取法、水蒸氣蒸餾法等報道[3-4]。但是壓榨法提取率較低；有機(jī)溶劑提取法容易造成有機(jī)溶劑殘留；超臨界流體萃取法雖然時間短、得率高，但其生產(chǎn)成本較高，難以在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用；水蒸氣蒸餾法是《中國藥典》中揮發(fā)油含量測定所推薦的方法，但耗時較長。因此，探索操作簡單、高提取率、低費(fèi)用的檸檬精油提取方法，依然是檸檬深加工綜合利用的關(guān)鍵，而采用超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取檸檬精油的工藝還未見報道。超聲波輔助提取技術(shù)是一種新的提取分離技術(shù)，具有時間短、溫度低、提取效率高等特點(diǎn)。因此，本試驗(yàn)擬以四川安岳的尤力克檸檬果皮為原料，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)研究超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取檸檬精油的最佳工藝參數(shù)，利用氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)對其化學(xué)成分進(jìn)行分析，再采用掃描電鏡觀察檸檬皮微觀結(jié)構(gòu)的變化，以便為檸檬精油的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

檸檬皮：將四川省安岳的新鮮尤力克檸檬果皮切碎，經(jīng)真空干燥至質(zhì)量恒定后待用。

1.2 主要儀器與設(shè)備

電子天平：TE412-L型，德國賽多利斯公司；

真空干燥箱：DZF-6020型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；

電熱套：SXKW型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-400DB型，昆山市超聲波儀器有限公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A-5975C型，安捷倫科技(中國)有限公司；

掃描電子顯微鏡：JSM-7500F型，日本電子株式會社。

1.3 精油提取方法

1.3.1 水蒸氣蒸餾提取法 按照《中國藥典》I部(2010年)附錄XD中甲法進(jìn)行提取。取50 g經(jīng)真空干燥后的檸檬皮，置圓底燒瓶，加數(shù)粒玻璃珠防止暴沸。將燒瓶與揮發(fā)油測定器和回流冷凝管連接，由冷凝管上端加水至揮發(fā)油測定器的刻度部分，并且溢流入燒瓶為止。再將燒瓶放置于電熱套中加熱到微沸，保持微沸5 h，當(dāng)揮發(fā)油測定器中的油量不再增加時，停止加熱，放置一定時間后開啟下端活塞，將水緩慢放出，讀取出油量，按式(1)計算精油提取率；其中檸檬精油相對密度的測定按GB/T 11540—2008《香料 相對密度的測定》進(jìn)行。

(1)

式中：

c——提取率，%；

m1——精油體積，mL；

ρ——精油密度，g/mL；

m2——檸檬皮質(zhì)量，g。

1.3.2 超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取工藝 將檸檬皮經(jīng)真空干燥至質(zhì)量恒定，稱取一定量檸檬皮置圓底燒瓶中，按比例加入適量蒸餾水，經(jīng)超聲波處理一定時間后，再連接揮發(fā)油提取裝置和冷凝管，用電熱套加熱至微沸，進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

(1) 超聲波功率：設(shè)定液料比10∶1 (mL/g)、超聲波時間25 min、蒸餾時間120 min，研究不同超聲波功率(160，200，240，280，320，360，400 W)對提取率的影響。

(2) 液料比：設(shè)定超聲波功率280 W、超聲波時間25 min、蒸餾時間120 min，研究不同液料比[7∶1，10∶1，13∶1，16∶1，19∶1，22∶1 (mL/g)]對提取率的影響。

(3) 超聲波時間：設(shè)定超聲波功率280 W、液料比13∶1 (mL/g)、蒸餾時間120 min，研究不同超聲波時間(15，20，25，30，35，40，45 min)對提取率的影響。

(4) 蒸餾時間：設(shè)定超聲波功率280 W、液料比13∶1 (mL/g)、超聲波時間30 min，研究不同蒸餾時間(60，90，120，150，180，210 min)對提取率的影響。

1.3.4 Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以超聲波功率、液料比、超聲波時間和蒸餾時間為自變量，提取率為響應(yīng)值，按照Box-Behnken Design(BBD)設(shè)計進(jìn)行響應(yīng)面(RSM)試驗(yàn)。

1.4 檸檬精油的化學(xué)成分檢測

采用GC-MS法。

(1) GC條件：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(柱長：30 m，膜厚：0.25 μm 內(nèi)徑：0.25 mm)；載氣為氦氣，流速為1 mL/min。進(jìn)樣量0.5 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣，解析時間5 min；升溫程序：起始溫度50 ℃，以3 ℃/min升溫至220 ℃，保持2 min[1]。

(2) MS條件：電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV，GC與MS接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；電子檢測器檢測電壓350 V；質(zhì)量掃描范圍10～450 amu[1]。

1.5 掃描電鏡觀察

將未經(jīng)處理、水蒸氣蒸餾和超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取后的檸檬皮原料，經(jīng)冷凍干燥后再噴金處理，通過掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲波功率對提取率的影響 由圖1可知，當(dāng)功率在160～280 W時，隨著超聲波功率的增大，提取率明顯上升；功率在280～360 W時，提取率隨功率的增加而增加但增幅減緩；功率在360 W以后，提取量下降。這可能是隨著超聲功率的增加，加快了細(xì)胞破碎程度，有利于精油溶出，故提取率上升；但在一定超聲時間下提高超聲功率會使溶劑溫度升高，可使精油中部分低沸點(diǎn)成分揮發(fā)而降低提取率；此外，超聲波功率過大，還可能會對精油組分的結(jié)構(gòu)造成破壞[5]。

圖1 超聲波功率對提取率的影響Figure 1 Effect of ultrasonic power on extraction rate

Karim等[6]在研究葛縷子精油的提取時證實(shí)，精油提取率隨著超聲波功率的提高而增加，但超過一定的功率后，提取率不再增加。因此，較適宜的超聲波功率為280 W。

2.1.2 液料比對提取率的影響 由圖2可知，液料比在7∶1～13∶1 (mL/g)時，提取率隨著液料比增大而升高；當(dāng)超過16∶1 (mL/g)后，提取率增加趨于平緩。通常適當(dāng)液料比可使原料浸泡充分，達(dá)到更好的質(zhì)壁分離效果；當(dāng)溶劑量達(dá)到一定程度后，物料與溶劑之間的擴(kuò)散趨于平衡，再繼續(xù)增加溶劑量已不能提高提取率。Sandrine等[7]在提取熏衣草油時，也得到了類似結(jié)論。所以，較適宜的液料比為13∶1(mL/g)。

圖2 液料比對提取率的影響Figure 2 Effect of the solvent to material ratio on extraction rate

2.1.3 超聲波時間對提取率的影響 由圖3可知，超聲波時間在15～30 min時，隨著超聲波處理時間的延長，提取率逐漸上升；在超聲波時間40 min后，提取率有所降低。原因主要是，隨著超聲時間的延長，細(xì)胞破碎程度增加，有利于精油進(jìn)入溶劑中；但由于精油是易揮發(fā)物質(zhì)，提取時間過長，超聲熱效應(yīng)過大，溫度過高，導(dǎo)致精油提取率下降；而且超聲波作用時間太長不僅增加成本，還可能會使精油成分受到影響。Daniella等[8]在研究柑橘皮精油提取過程中，也認(rèn)為提取率隨著超聲波時間的延長而增長，但在一定時間后，提取率不再增加。因此，較適宜的超聲波作用時間為30 min。

2.1.4 蒸餾時間對提取率的影響 由圖4可知，蒸餾時間在60～150 min時，隨著蒸餾時間的延長，提取率明顯增加；蒸餾時間在150 min后，提取率增幅不明顯。這可能是隨著蒸餾時間的延長，檸檬果皮細(xì)胞中的精油成分不斷被溶出，使提取率上升；但超過150 min后，精油已經(jīng)基本溶出，提取率趨于平緩，繼續(xù)延長蒸餾時間對提取率影響不大。Ljiljana等[9]在采用水蒸氣蒸餾提取蒔蘿籽精油時，也得到了類似結(jié)論。所以，較適宜的蒸餾時間為150 min。

圖3 超聲波時間對提取率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic time on extraction rate

圖4 蒸餾時間對提取率的影響Figure 4 Effect of distilling time on extraction rate

2.2 Box-Behnken Design試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面模型的建立 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以超聲波功率、液料比、超聲波時間和蒸餾時間為自變量，以提取率為響應(yīng)值，按照Design-expert 9.0軟件采用BBD設(shè)計RSM試驗(yàn)。其中為了縮短提取時間，節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本，將時間范圍設(shè)置在90～150 min。各因素的具體取值見表1，RSM的結(jié)果見表2。

采用Design-expert 9.0軟件對表2的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到了提取率與超聲波功率、液料比、超聲波時間和蒸餾時間的二次回歸方程模型：

Y=1.82+4.466 67E-003A+0.07B+0.04C+0.02D+1.458 33E-004AB+3.750 00E-005AC+1.666 67E-005AD+9.166 67E-004BC+4.166 67E-004BD-8.333 33E-005CD-1.489 58E-005A2-5.870 37E-003B2-7.408 33E-0.04C2-9.898 15E-0.05D2。

(2)

2.2.2 響應(yīng)面模型的顯著性檢驗(yàn) 通過對二次回歸方程模型進(jìn)行方差分析，對模型的系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface method

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Experiment design and results of response surface methodology

2.2.3 各因子間交互作用的響應(yīng)面分析 各因子間交互作用的響應(yīng)面分析見圖5。

由圖5(a)可知，當(dāng)超聲波時間和蒸餾時間處于中心點(diǎn)位置時，當(dāng)液料比一定，隨著超聲波功率的增加，提取率呈現(xiàn)先增加后減小。當(dāng)超聲波功率一定，隨著液料比的增高，提取率先增加后趨于平緩。所以，超聲波功率和液料比對提取率存在顯著交互作用。

由圖5(b)可可知，當(dāng)液料比和蒸餾時間處在中心點(diǎn)位置時，當(dāng)超聲波時間一定時，隨著超聲波功率的增加，提取率先上升后減小。當(dāng)超聲波功率一定時，隨著超聲波時間的延長，提取率先上升后減小。因此，超聲波功率和超聲波時間對提取率產(chǎn)生了顯著的交互影響。

表3 回歸方程的方差分析?Table 3 Variance analysis of regression equation

由圖5(c)可知，當(dāng)液料比和超聲波時間處在中心點(diǎn)位置時，當(dāng)蒸餾時間一定時，隨著超聲波功率的增高，提取率顯著上升后緩慢降低。當(dāng)超聲波的功率一定時，隨著蒸餾時間的延長，提取率先上升后減小。因此，超聲波功率和蒸餾時間對提取率有極顯著交互影響。

由圖5(d)可知，當(dāng)超聲波功率和蒸餾時間處在中心點(diǎn)位置時，當(dāng)超聲波時間一定時，隨著液料比的增加，提取率先增加然后逐漸趨于平緩。當(dāng)液料比一定時，隨著超聲波時間的延長，提取率先增加再減小。所以，液料比和超聲波時間對提取率有顯著交互影響。

由圖5(e)可知，當(dāng)超聲波功率和超聲波時間處在中心點(diǎn)位置時，當(dāng)蒸餾時間一定時，隨著液料比的增加，提取率先上升后逐漸減少。當(dāng)液料比一定時，隨著蒸餾時間的延長，提取率先增加后減小。所以，液料比和蒸餾時間對提取率有顯著交互影響。

由圖5(f)可知，當(dāng)超聲波功率和液料比處在中心點(diǎn)位置時，當(dāng)蒸餾時間一定時，隨著超聲波時間的延長，提取率先上升后減小。當(dāng)超聲波時間一定時，隨著蒸餾時間的延長，提取率先增加后趨于穩(wěn)定。因此，超聲波時間和蒸餾時間對提取率有顯著交互影響。

圖5 兩因子交互作用對提取率影響的響應(yīng)面圖Figure 5 Response surface of mutual-influence of two factors on extraction rate

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過Design-expert 9.0軟件對方程進(jìn)行求解，得出檸檬精油理想的提取工藝為：超聲波功率321.69 W、液料比15.43∶1 (mL/g)、超聲波時間36.28 min、提取時間140.84 min，理論提取率2.03%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)過程中操作的可行性，將提取工藝條件修正為：超聲波功率320 W、液料比15.5∶1 (mL/g)、超聲波時間36 min、提取時間140 min。該條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到提取率的平均值為1.97%，與理論預(yù)測值基本相吻合。表明該提取工藝條件的參數(shù)可靠，具有實(shí)際的應(yīng)用價值。

2.3 檸檬精油的化學(xué)成分分析

水蒸氣蒸餾和超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取檸檬精油的總離子流圖見圖6。

利用NIST11質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對照解析，取匹配度85%以上數(shù)據(jù)，通過峰面積歸一化法計算精油中各成分的相對含量，解析鑒定的結(jié)果見表4。

由表4可知，2種工藝提取檸檬精油的化學(xué)成分基本一致，表明超聲波輔助提取保留了檸檬精油的原有成分，沒有對其產(chǎn)生破壞。超聲波輔助提取的檸檬精油共鑒定出26種化學(xué)成分，占總成分的96.16%。其主要成分是烯烴類、醇類、醛類和酯類化合物，尤其以烯類化合物為主，相對含量占總質(zhì)量分?jǐn)?shù)在85%以上。Vaio等[10]和Al-Jabri等[11]分別檢測了乙醇提取和水蒸氣蒸餾提取檸檬精油的化學(xué)成分，結(jié)果均證實(shí)檸檬烯、月桂烯、β-蒎烯、萜品烯、α-蒎烯等是其主要特征組分，與本研究的結(jié)果類似。

2.4 2種方法提取率的比較

檸檬精油2種提取方法測定結(jié)果見表5。

由表5可見，2種方法提取率相近，但超聲波輔助提取法明顯縮短了精油提取時間。這是由于一定頻率超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈振動和空化效應(yīng)可使細(xì)胞壁破裂，提高萃取成分的運(yùn)動速度，縮短了提取時間。Morsy等[12]在提取小豆蔻精油時證實(shí)，采用超聲波預(yù)處理后進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，可明顯降低水蒸氣蒸餾時間，節(jié)約能耗。Tekin等[13]在采用超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取丁香精油時，也得出了類似結(jié)論。由此可見，與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取法相比，超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取檸檬精油可以縮短提取時間，降低能耗。

圖6 水蒸氣蒸餾和超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取檸檬精油的總離子流圖Figure 6 Total ion current of essential oil of lemon from hydrodistillation and ultrasonic-assisted extraction表4 2種方法提取檸檬精油的化學(xué)成分分析Table 4 Analyses of chemical components oil of lemon extracted by two extraction methods

序號化合物水蒸氣蒸餾保留時間/min含量/%超聲波輔助水蒸氣蒸餾保留時間/min含量/%1α-蒎烯10.963.2310.933.512樟腦萜11.680.1011.660.123β-蒎烯12.979.2512.959.544月桂烯13.955.2213.924.945檸檬烯16.1561.8116.1764.666羅勒烯16.930.1916.790.207萜品烯17.353.3117.212.948異松油烯18.520.5518.450.369芳樟醇19.321.0919.250.8410樟腦未檢出20.210.1011(R)-氧化檸檬烯未檢出20.910.8012香茅醛21.670.2221.630.1413a-松油醇未檢出23.520.7514癸醛24.160.6224.120.42 15(Z)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛25.841.8625.781.4216檸檬醛27.231.8327.181.48173,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇甲酸酯25.570.10未檢出18十一醛28.730.1228.740.1019α-蓽澄茄油烯30.460.1130.470.1120乙酸橙花酯31.260.9431.290.92212-莰烯31.870.1031.860.1022乙酸香葉酯32.090.6432.120.52231-石竹烯33.430.5433.450.5024α-法尼烯34.161.2834.180.8925(E)-β-金合歡烯35.870.1236.150.2126巴倫西亞橘烯36.450.5836.490.4227氧化石竹烯40.020.2740.030.17合計94.0896.16

表5 2種提取方法提取率的比較Table 5 Comparisons of extraction rate of two extraction methods

2.5 提取方法對檸檬皮超微結(jié)構(gòu)的影響

采用掃描電鏡對未經(jīng)處理、水蒸氣蒸餾、超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取后的檸檬皮超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，結(jié)果見圖7。

圖7 未經(jīng)處理、水蒸氣蒸餾、超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取后的檸檬皮掃描電鏡觀察

Figure 7 Scanning electron micrographs of lemon peel: lemon peel without treatment, lemon peel by hydrodistillation, lemon peel by ultrasonic-assisted extraction

由圖7可以看出，水蒸氣蒸餾和超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取的檸檬皮結(jié)構(gòu)與未經(jīng)處理的檸檬皮結(jié)構(gòu)存在明顯差異：未經(jīng)處理的檸檬皮表面平滑和完整；水蒸氣蒸餾提取后的檸檬皮表面部分結(jié)構(gòu)遭到破壞；超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取后的檸檬皮表面結(jié)構(gòu)完全遭到破壞，出現(xiàn)了許多不規(guī)則的空腔、裂痕。

通常植物原料中有效成分的溶出，與原料細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞程度密切相關(guān)。在超聲波輔助提取檸檬精油過程中，超聲波對檸檬皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞程度超過了水蒸氣蒸餾，使得檸檬精油能夠快速釋放，從而縮短了提取時間，與表5的研究結(jié)果一致。Sereshti等[14]在采用超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取豆蔻精油時證實(shí)，經(jīng)超聲波處理后的原料表面結(jié)構(gòu)顯著破壞，促進(jìn)了精油的有效提取。Maral等[15]在采用超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取栓翅芹精油時，也得出了類似結(jié)論。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定了超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取檸檬精油的最佳工藝條件為：超聲波功率320 W、液料比15.5∶1 (mL/g)、超聲波時間36 min、蒸餾時間140 min，提取率可達(dá)1.97%，所得精油為淡黃色液體，其香氣接近鮮檸檬果香。該檸檬精油共鑒定出26種化學(xué)成分，占總成分的96.16%，其主要成分為檸檬烯。此外，掃描電鏡觀察表明，超聲波通過有效破壞原料的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了精油的快速釋放。本工藝與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取相比，提取率相近，但明顯縮短了提取時間，減少能耗。所以，超聲波輔助水蒸氣蒸餾提取檸檬精油是一種有效的精油提取方法。