熒光染色法與KOH濕片法的回顧性研究

李翔英 廉翠紅

(深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院 (深圳市第二人民醫(yī)院)皮膚科，深圳 518035)

淺部真菌病是皮膚病中的常見病和多發(fā)病，建立一種快速而準確的檢驗方法尤為重要。常用的真菌檢驗方法有直接鏡檢、真菌培養(yǎng)、組織病理等。由于直接鏡檢方法簡便，可快速得出檢驗結(jié)果，是臨床最常用的檢驗方法之一。真菌直接鏡檢有多種浮載液可供選擇，其中KOH使用最為廣泛，其缺點是角質(zhì)溶解慢，一般需要加熱，加熱不當(dāng)易致氣泡產(chǎn)生，且成片背景雜亂，真菌結(jié)構(gòu)不易分辨和判斷，易出現(xiàn)假陰性或漏診；熒光染色法是一種利用重組幾丁質(zhì)酶來檢測標(biāo)本中是否存在真菌有形成分的方法。真菌熒光染色液中，經(jīng)過特殊熒光素標(biāo)聯(lián)的重組幾丁質(zhì)酶可以高親和力與真菌細胞壁上的幾丁質(zhì)結(jié)合并發(fā)出熒光，在熒光顯微鏡下可以清楚的觀察到真菌形態(tài)。浮載液體用熒光染色液替代KOH溶液，鏡下菌絲形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚易辨，背景干凈、清晰，反差大，孢子染色后結(jié)構(gòu)清晰，易于分辨，大大提高真菌陽性率，且顯著縮短真菌鏡檢時間。

1 對象與方法

1.1 病例選擇

選取2017年6月1日～8月31日于我科進行真菌直接鏡檢的患者，共獲得病例716例，其中熒光染色法548例，KOH濕片法168例，取材來源包括疑似體癬、股癬、花斑糠疹、手足癬等患者的皮損。

1.2 材料

10%KOH溶液 (實驗室自配)；真菌熒光染色液 (萊芙特敏真菌熒光染色液)。

1.3 操作步驟

①取材：75%酒精消毒患處后，用鈍刀刮取患處或用透明膠帶粘取患處皮屑；皮屑取皮損的活動性邊緣；水皰取皰壁和基底部皮損；膿皰取膿液，間擦性皮損去除浸漬表皮，刮取基底部損害；采集甲標(biāo)本時刮取靠近病甲甲床的碎屑。②KOH濕片法：將皮屑置于玻片中央，滴1滴KOH后蓋上蓋玻片，并過火焰2～3次輕微加溫，輕壓蓋玻片吸出多余液體后，置于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡查找菌體，然后換高倍鏡觀察菌體結(jié)構(gòu)，以查到菌絲或孢子為陽性結(jié)果。③熒光染色法：將皮屑置于玻片中央，滴1滴熒光染色液后蓋上蓋玻片，輕壓蓋玻片吸出多余染色液后，置于熒光顯微鏡下查找真菌菌絲或孢子。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS 9.1統(tǒng)計學(xué)軟件對檢查結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本次實驗共納入病例716例，包括男性患者379例，女性患者343例，男女比例約為1.12∶1，包括手足癬、體股癬、花斑糠疹、甲癬等。熒光染色法共548例，陽性患者309例，陽性率為56.4%；KOH濕片法共168例，陽性患者50例，陽性率為29.8%。用SAS 9.1統(tǒng)計學(xué)軟件對兩組數(shù)據(jù)進行卡方檢驗，P<0.01，說明熒光染色組和KOH濕片法組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，熒光染色法組陽性率明顯高于KOH濕片法組。

從表1可知，體股癬組、花斑糠疹組熒光染色法陽性率明顯高于KOH濕片法 (P<0.01)。但在手足癬組、甲癬組，雖然實驗組陽性率高于對照組，但經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)檢驗P>0.01，顯示兩組數(shù)據(jù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮原因為：①手足癬足及甲癬組樣本量較少，尤其是對照組樣本量少；實驗組與對照組樣本數(shù)量差異較大；②檢驗人員的經(jīng)驗不足及操作不當(dāng)；③臨床醫(yī)生診斷經(jīng)驗不足。后續(xù)改進措施：①擴大樣本量；②設(shè)計嚴格的對照實驗，如自身對照，確定合理的實驗組及對照組樣本量；③對檢驗人員進行培訓(xùn)及定期考核，規(guī)范操作流程。

表1熒光染色法與KOH濕片法陽性率的比較

Tab.1The comparison of positive rate in Fluorescent Staining and KOH Wet Method

熒光染色法KOH濕片法例數(shù)陽性陽性率例數(shù)陽性陽性率P值手足癬1012625.7%49816.3%0.196體股癬23715766.2%782532.1%0.0001花斑糠疹1228872.1%351645.7%0.0036甲癬883843.2%6116.7%0.395合計54830956.4%1685029.8%<0.01

3 討 論

本次研究中，圖1為1例股癬患者KOH濕片法的10×40倍鏡下觀，可以看到交織呈網(wǎng)狀的細長菌絲和散在孢子，但背景雜亂，菌體結(jié)構(gòu)顯示不清，嚴重影響結(jié)果判讀。圖2～4分別為股癬、甲癬、花斑糠疹患者熒光染色法的鏡下觀，在熒光下，可以看到真菌菌絲及孢子含有幾丁質(zhì)的細胞壁呈現(xiàn)熒光藍色，與背景對比明顯，可見菌絲橫隔，更易快速、準確地對檢測結(jié)果進行判讀，大幅提高檢驗的陽性率及檢驗效率。

淺部真菌病，尤其是皮膚癬菌病是皮膚科的常見病、多發(fā)病，真菌直接鏡檢是一種簡單、經(jīng)濟、高效的真菌檢驗方法，能有效提高真菌病的診斷率，減少誤診。為了更快、更準確的為臨床提供診斷依據(jù)，真菌直接鏡檢的浮載液經(jīng)過不斷的改良[1-8]，目前最常用于臨床的是KOH溶液、KOH可以軟化和溶解角蛋白、脂肪等組織碎屑，使真菌形態(tài)更清晰，但背景雜亂等問題一直無法得到較好的解決，導(dǎo)致KOH濕片法直接鏡檢有較高的陰性率和假陽性率，且嚴重依賴于檢驗人員的技術(shù)水平。熒光染色液中熒光標(biāo)記的重組幾丁質(zhì)酶可以特異性的與真菌細胞壁上的幾丁質(zhì)結(jié)合，而角蛋白、脂質(zhì)等成分不著色，使真菌菌絲和孢子與背景對比明顯，解決了KOH濕片法中背景雜亂的問題，大幅提高真菌鏡檢的陽性率，且不需要加熱加速角質(zhì)溶解，具有操作簡便、快捷等優(yōu)點，值得臨床推廣。

圖1菌絲KOH濕片法鏡下觀 (10×40)圖2～4菌絲及孢子熒光染色法鏡下觀 (10×40)

Fig.1Hyphae in KOH Wet MethodFig.2-4Hyphaeand spores in Fluorescent Staining