張洪瑞，朱其松，李廣賢，周學(xué)標(biāo)，袁守江

(山東省水稻研究所,山東 濟(jì)南 250100)

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球一半以上的人口以稻米為主食，同時它也是我國最主要的栽培作物之一。近半個世紀(jì)以來，三系和兩系雜交水稻的選育成功，使得我國的水稻單產(chǎn)取得了大的飛躍。然而雜交水稻在發(fā)展初期也受諸多因素困擾，其中尤為突出的是制種產(chǎn)量低、異交結(jié)實(shí)差，從而導(dǎo)致制種成本居高不下，限制了雜交水稻尤其是雜交粳稻的大面積推廣[1]。柱頭外露率是野生稻和栽培稻之間一個重要的分類性狀，也是一個重要的農(nóng)藝性狀，柱頭外露率的高低是反映三系和兩系不育系雜交結(jié)實(shí)性的一個重要農(nóng)藝指標(biāo)。對控制柱頭外露率的基因進(jìn)行定位和克隆，不僅可從功能基因方面揭示水稻起源演化的分子機(jī)理，而且在生產(chǎn)上對水稻育種有重大應(yīng)用意義[2]。改良水稻雄性不育系的柱頭外露率，提高雜交水稻制種產(chǎn)量，降低種子生產(chǎn)成本，是當(dāng)前國內(nèi)外水稻育種專家發(fā)展雜交水稻生產(chǎn)亟待解決的關(guān)鍵問題之一[3]。柱頭外露率在野生稻中表現(xiàn)較高，而在栽培稻中表現(xiàn)相對較低。在栽培稻中，柱頭外露率在不同品種間變異也很大[4]，尤其在水稻秈粳亞種間差異顯著，一般而言，秈稻品種的柱頭外露率普遍高于粳稻品種[5]。

有關(guān)柱頭外露率的遺傳特性，多數(shù)研究表明柱頭外露相關(guān)性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀[3,6-9]。目前為止，李文宏等[2]利用窄葉青8號和京系17構(gòu)建DH群體，檢測到2個控制水稻柱頭外露率的QTL；沈圣泉等[4]利用協(xié)青早B和密陽46構(gòu)建RIL群體，檢測到1個QTL；李晨等[10]利用栽培稻和普通野生稻構(gòu)建BC1群體，檢測到2個QTL；Uga等[6]利用Peikuh和W1944構(gòu)建RIL-F8群體，檢測到2個控制柱頭外露率的QTL。

本研究利用由貴2136S/日本晴配制的F2群體構(gòu)建了一張關(guān)于水稻柱頭外露的遺傳連鎖圖譜，利用覆蓋全基因組的InDel和SSR兩種分子標(biāo)記對柱頭單邊外露率、柱頭雙邊外露率、柱頭總外露率、穗粒數(shù)和柱頭顏色進(jìn)行QTL分析，盡可能發(fā)掘有利用價值的控制花器性狀的等位基因，為雜交水稻花器性狀的遺傳改良提供輔助選擇標(biāo)記，應(yīng)用于遺傳育種實(shí)踐，從而培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)水稻新品種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以柱頭外露率高、柱頭顏色為紫色的秈稻兩系不育系貴2136S與柱頭外露率低、柱頭顏色為白色的粳稻品種日本晴(Nipponbare)作為親本，以300株2136S/日本晴的F2單株為QTL初步定位群體。

1.2 DNA提取及PCR分析

試驗(yàn)采用CTAB法提取F2代各單株葉片總DNA[11]，利用篩選出的多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物利用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為0.5×TBE，電泳后采用AgNO3顯色。

1.3 性狀調(diào)查

2009年冬，在海南南繁基地，調(diào)查親本貴2136S和日本晴以及F2代柱頭外露的相關(guān)性狀。分別取兩親本各20個單株、 F2群體300個單株進(jìn)行相關(guān)性狀表型考查，以平均值表示。每株選取穎花完全盛開后的3～5穗主穗，計(jì)數(shù)柱頭單邊外露數(shù)、柱頭雙邊外露數(shù)、柱頭不露的穎花數(shù)和柱頭顏色，并統(tǒng)計(jì)各柱頭外露性狀的比率，柱頭單邊外露率(percentage of single exserted stigma, PSES)、柱頭雙邊外露率(percentage of dual exserted stigma, PDES)、柱頭總外露率(percentage of total exserted stigma, PES)、穗粒數(shù)(spikelets per panicle, SPP)和柱頭顏色(stigma color, SC)。

1.4 構(gòu)建遺傳圖譜及QTL分析

由已公布的水稻基因組序列信息[12,13]，利用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)片段大小為150～250 bp的InDel分子標(biāo)記,另基于公開發(fā)表的水稻SSR圖譜(http://www.gramene.org/)序列，針對親本貴2136S與日本晴，篩選具有多態(tài)性的分子標(biāo)記。采用復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)，利用QTL IciMapping 3.1軟件(http://www.isbreeding.net/) 對F2分離群體進(jìn)行全基因組掃描，LOD值2.5作為閾值，建立與目標(biāo)基因連鎖的標(biāo)記遺傳圖，計(jì)算每個QTL對應(yīng)性狀的貢獻(xiàn)率，QTL的命名原則遵循文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及群體的性狀分析

由表1可見，母本貴2136S的柱頭單邊外露率(PSES)、柱頭雙邊外露率(PDES)、柱頭總外露率(PES)和穗粒數(shù)(SPP)分別為48.2%、35.1%、83.3%和180；父本日本晴的柱頭單邊外露率、柱頭雙邊外露率、柱頭總外露率和穗粒數(shù)分別為3.1%、0.2%、3.3%和104；兩親本各柱頭外露性狀存在明顯差異。由圖1、圖2、 圖3所示，F(xiàn)2群體柱頭單邊外露率與柱頭雙邊外露率表現(xiàn)出連續(xù)變異，其偏態(tài)系數(shù)和峰度系數(shù)均小于1，呈正態(tài)分布；平均值分別為32.9%、16.1%，其變異范圍(即最大值和最小值)都超出了親本的表型值，出現(xiàn)了超親分離現(xiàn)象，表現(xiàn)出數(shù)量性狀的特征；適合用QTL相關(guān)軟件進(jìn)行數(shù)量性狀分析。柱頭總外露率呈雙峰連續(xù)分布特征，說明該性狀可能是由一個主效基因與多個微效基因共同控制的性狀。

表1 雙親及F2群體的柱頭外露率表型

圖1 貴2136S/日本晴F2群體柱頭單邊外露率頻率分布

圖2 貴2136S/日本晴F2群體柱頭雙邊外露率頻率分布

圖3 貴2136S/日本晴F2群體柱頭總外露率頻率分布

2.2 各性狀間相關(guān)分析

對親本貴2136S、日本晴以及貴2136S/日本晴的F2群體單株的柱頭單邊外露率、柱頭雙邊外露率、柱頭總外露率和穗粒數(shù)性狀進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果見表2。柱頭總外露率與柱頭單邊外露率和柱頭雙邊外露率兩兩之間均具有極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.836、0.863和0.444，由此推測控制柱頭總外露率和柱頭單邊外露率或柱頭雙邊外露率的基因可能是相同基因或同源基因；柱頭各外露性狀和穗粒數(shù)沒有明顯的相關(guān)性，推測柱頭外露性狀與穗粒數(shù)由不同的基因控制。

表2 雙親及F2群體中各性狀的相關(guān)分析(Pearson函數(shù))

注：**表示0.01顯著水平。

2.3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

共篩選出153對多態(tài)標(biāo)記，包括7對SSR標(biāo)記和146對InDel標(biāo)記，對F2代進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用QTL IciMapping 3.1軟件，構(gòu)建了關(guān)于柱頭單邊外露率、柱頭雙邊外露率、柱頭總外露率、穗粒數(shù)和柱頭顏色(SC)的遺傳連鎖圖。圖譜總長1 921.03 cM，標(biāo)記間平均距離為12.56 cM，如圖4。

2.4 有關(guān)柱頭外露率QTL定位

關(guān)于柱頭單邊外露率、柱頭雙邊外露率、柱頭總外露率、穗粒數(shù)和柱頭顏色五個性狀共檢測出38個QTL，分布于12條染色體上(圖4、圖5、圖6和表3)。其中6個LOD值與貢獻(xiàn)率較高的主效QTL的增效基因均來自貴2136S等位基因的相關(guān)位點(diǎn)。

柱頭單邊外露率：檢測到1個影響柱頭單邊外露率的主效QTL，位于3號染色體RM5488～I(xiàn)-3-21之間，命名為qPSES-3。其LOD值和貢獻(xiàn)率分別為13.122和21.108%。

柱頭雙邊外露率：檢測到1個影響柱頭雙邊外露率的主效QTL，位于3號染色體105 cM處，I-3-18～RM5488之間，命名為qPDES-3，其中LOD值和貢獻(xiàn)率分別為19.454和29.780%。

圖4 貴2136S/日本晴F2群體的遺傳連鎖圖譜

圖5 有關(guān)柱頭單邊外露率、柱頭雙邊外露率、柱頭總外露率、穗粒數(shù)和柱頭顏色QTL的似然值

圖6 有關(guān)柱頭單邊外露率、柱頭雙邊外露率、柱頭總外露率、穗粒數(shù)和柱頭顏色QTL的貢獻(xiàn)率

表3水稻貴2136S/日本晴F2群體柱頭外露率的QTL定位

柱頭總外露率：檢測到1個影響柱頭總外露率的QTL，位于3號染色體RM5488～I(xiàn)-3-21之間，命名為qPES-3，LOD值和貢獻(xiàn)率分別為21.579和25.659%。

穗粒數(shù)：檢測到1個影響穗粒數(shù)的主效QTL，命名為qSPP-6，位于6號染色體的I-6-4～I(xiàn)-6-5區(qū)間，LOD值和貢獻(xiàn)率分別為14.991和22.151%。

柱頭顏色：檢測到2個影響柱頭顏色的主效QTL，分別命名qSC-1、qSC-6。其中qSC-1位于1號染色體I-1-10～I(xiàn)-1-12之間，LOD值和貢獻(xiàn)率分別為27.662和47.209%，該位點(diǎn)的增效基因來自貴2136S等位基因位點(diǎn)。qSC-6位于6號染色體I-6-2～I(xiàn)-6-3之間，LOD值和貢獻(xiàn)率分別為27.453和40.982%。

3 討論與結(jié)論

水稻是典型的自花授粉作物，花器構(gòu)造適于自交而不利于異交，其柱頭外露率的高低決定了母本受粉能力，直接影響了水稻不育系繁殖以及雜交稻制種產(chǎn)量；柱頭外露率和柱頭相關(guān)性狀是建立水稻異交栽培理論和技術(shù)的重要依據(jù)，也是選育不育系的重要目標(biāo)性狀。

本研究選用的母本貴2136S為兩系法雜交水稻兩用核不育系的秈型水稻，從分子水平研究其性狀，可為雜交制種提供理論依據(jù)，具有重大意義。本研究共統(tǒng)計(jì)了300株F2群體各性狀的表型，為了增加基因型分析的有效性[15]選擇了237株雙尾極端表型個體，分析了各標(biāo)記與所有QTL的連鎖關(guān)系。本研究通過貴2136S/日本晴構(gòu)建的F2群體柱頭外露性狀的QTL檢測與分析，發(fā)現(xiàn)柱頭外露率是由多基因控制的數(shù)量性狀，并將控制柱頭外露率的QTL初步定位在第3染色體，同時發(fā)現(xiàn)控制柱頭單邊外露率和柱頭總外露率的QTL完全一致，這與前人的報(bào)道一致[2, 16-18]。李文宏等[2]利用DH群體檢測到控制水稻柱頭外露率的QTL位于第2、3染色體，同時定位控制穗粒數(shù)的QTL于第6、8染色體上，與柱頭外露率之間沒有連鎖關(guān)系。Miyata等[16]利用Koshihikari和98SQ1496配制的F2群體，檢測到控制柱頭外露的QTL定位在第3染色體。Yu等[17]利用RIL群體，檢測到控制柱頭外露的QTL定位在第3、5、12號染色體。馮玲玲等[18]利用50S和連B構(gòu)建F2群體，檢測柱頭外露率在第3、9、12染色體，其貢獻(xiàn)率分別為8.7%、4.9%和5.3%。推測該染色體標(biāo)記區(qū)段的確可能存在影響柱頭外露率的QTL，而且目標(biāo)基因可能具一因多效性，可開發(fā)出與目標(biāo)QTL位點(diǎn)兩側(cè)都緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過構(gòu)建大量精細(xì)定位群體，更精細(xì)定位并進(jìn)一步克隆該QTL位點(diǎn)，分析其功能蛋白的作用模式。

由于柱頭外露率遺傳背景多樣，受多基因控制，并受環(huán)境影響[4]，此外還受群體類型、大小、閾值、目標(biāo)性狀的遺傳力限制[19]以及親本遺傳背景的影響[20]等，諸多因素導(dǎo)致各研究定位結(jié)果有所差異。初步統(tǒng)計(jì)，有關(guān)柱頭外露率的QTL已檢測出40多個，分布在不同位置。

本研究檢測到穗粒數(shù)相關(guān)QTL定位在第6染色體I-6-4～I(xiàn)-6-5之間，與柱頭外露率之間無顯著連鎖關(guān)系。李文宏等[2]利用窄葉青8號/京系17配制的DH群體，也將控制穗粒數(shù)的QTL定位在第6染色體，不過具體位置不一致，應(yīng)利用更大群體繼續(xù)精確定位研究。關(guān)于柱頭顏色的定位，本研究統(tǒng)計(jì)了300株F2群體柱頭顏色，發(fā)現(xiàn)分離比為2∶1，不符合孟德爾質(zhì)量性狀遺傳規(guī)律，遂用QTL軟件分析，紫色記為1，無色記為0。在前人的研究中，尚未有柱頭顏色定位的報(bào)道。本研究檢測到2個柱頭顏色QTL，分別位于第1染色體和第6染色體I-1-10～I(xiàn)-1-12之間和I-6-2～I(xiàn)-6-3之間，貢獻(xiàn)率分別為47.209%和40.982%，總貢獻(xiàn)率為88.191%，為主效QTL，增效基因來自貴2136S?？寺∨c柱頭顏色相關(guān)的QTL，研究并分析其表達(dá)蛋白功能作用方式，可將其應(yīng)用到大田育種，便于識別，減輕雜交育種工作量，以促進(jìn)雜交粳稻的發(fā)展。

在水稻的遺傳學(xué)研究中，應(yīng)擴(kuò)大研究材料，利用不同群體進(jìn)行研究，全面準(zhǔn)確了解水稻各性狀之間的相關(guān)性，進(jìn)一步明確水稻各種性狀的遺傳控制機(jī)理。