譚非 徐星 高品 蘇向前

結(jié)直腸癌是全球范圍內(nèi)死亡率較高的惡性腫瘤之一［1］。自20世紀80年代以來，內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展使得結(jié)直腸癌的早期診斷成為可能，死亡率呈下降趨勢［2］，而晚期結(jié)直腸癌最主要的死亡原因為腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤在發(fā)展過程中突破基底膜對周邊組織發(fā)動浸潤與侵襲是轉(zhuǎn)移過程中重要的早期事件，該表型對于腫瘤分期具有決定性的影響，也是區(qū)分良性與惡性腫瘤的重要標(biāo)準(zhǔn)［3］。因此，了解并抑制腫瘤的侵襲過程有利于改善結(jié)直腸癌的治療。

miRNAs是非編碼小RNA家族的重要成員，可以通過互補配對的形式結(jié)合于靶基因mRNA的3'UTR區(qū)，造成靶基因mRNA降解等，對靶基因的表達水平發(fā)揮負調(diào)控作用［4］。miR-520是與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的一個重要miRNA家族，其成員miR-524對腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)揮抑制作用［5］。結(jié)直腸癌的發(fā)生同樣受到miR-520的調(diào)控，前期本課題組的小臨床樣本量研究發(fā)現(xiàn)，miR-520d-5p在結(jié)直腸癌原發(fā)癌中表達水平發(fā)生下調(diào)，過表達miR-520d-5p會降低結(jié)直腸腫瘤細胞的侵襲能力［6］。而作為miR-520d-5p的潛在靶標(biāo)基因，膠原三股螺旋重疊蛋白1（collagen triple helix repeat containing 1，CTHRC1）在多種腫瘤細胞中均被報道存在表達水平的上調(diào)，如胃癌［7］、結(jié)直腸癌［8-9］。在機制方面，基因CTHRC1可以通過上調(diào)MMP-7/MMP-9以及活化Wnt/PCP信號通路等方式促進腫瘤細胞的侵襲能力［10-11］。

本研究通過在結(jié)直腸癌細胞系中過表達基因CTHRC1探討此基因?qū)Y(jié)直腸癌腫瘤細胞的侵襲能力的影響。進一步擴展臨床樣本總量對基因CTHRC1的表達規(guī)律開展了多中心分析，以確定基因CTHRC1在結(jié)直腸癌中的臨床意義以及與miR-520d-5P的臨床相關(guān)性，從而揭示基因CTHRC1與miR-520d-5P之間存在的平衡關(guān)系是否對正常結(jié)直腸功能的維持以及結(jié)直腸癌的發(fā)生存在影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 選取2016年1月至2016年6月北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院行手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者，取同一患者配對癌組織及正常組織于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆?，后期選取其中23對配對合格組織標(biāo)本進行下一步實驗。

1.1.2 細胞系及載體 人結(jié)直腸癌細胞株SW480、SW620、HCT116、LS174、HT29、LOVO和HEK293T均購自美國ATCC公司。根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）提供的CTHRC1基因序列設(shè)計引物以擴增目的基因編碼序列的全長，重組質(zhì)粒的構(gòu)建引物序列如下：CTHRC1（4123-3）-P1：GAGGATCCCCGGGTACCG GTCGCCACCATGCGACCCCAGGGC；CTHRC1（4123-3）-P2：TCCTTGTAGTCCATACCTTTTGGTAGTTCTTCAAT AATGATGCG。將回收的基因CTHRC1片段與GV287線性化片段進行連接反應(yīng)，構(gòu)建CTHRC1基因重組載體GV287-CTHRC1及GV287空載體質(zhì)粒，按步驟制成含基因CTHRC1序列的慢病毒（GV287-CTHRC1）和空白對照病毒（GV287）［12］。

1.1.3 試劑 RMPI 1640培養(yǎng)基及胎牛血清購自美國Hyclone公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，CTHRC1和GAPDH引物均購自日本Takara公司。CCK-8試劑盒購自南京凱基公司，Transwell小室購自美國Coring公司，基質(zhì)膠購自美國BD公司。兔抗人CTHRC1、GAPDH多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 6株結(jié)直腸癌細胞均以含10%胎牛血清的RMPI 1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2飽和濕度的條件下適時傳代培養(yǎng)。

1.2.2 Western blot檢測基因CTHRC1在組織和細胞的蛋白表達水平 提取組織或細胞總蛋白，以BCA法測量蛋白濃度。10%SDSPAGE膠電泳后，恒流轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，含10%TBST脫脂牛奶室溫封閉1 h，相應(yīng)的一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，再以過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，10%TBST洗3遍，10 min/次。GAPDH為內(nèi)參，SynGene顯影儀顯影。

1.2.3 CCK8細胞增殖實驗 以100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板中（每孔約800個細胞），每組設(shè)3個復(fù)孔，同時以Blank為對照（僅加培養(yǎng)基），連續(xù)培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 d。檢測前每孔加入10 μL CCK8試劑，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h后終止培養(yǎng)，以Blank為對照孔調(diào)零，酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值（OD值），波長為450 nm，細胞增殖能力以相對應(yīng)OD值表示。各組取3孔平均值，進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell小室細胞運動實驗 所用Transwell小室內(nèi)的膜材料為聚碳酸酯，選擇孔徑為8.0 μm的小室進行試驗。取細胞計數(shù)為5×105/mL的單細胞懸液，加入200 μL懸液于內(nèi)室，加入600 μL完全培養(yǎng)基于下室，37℃培養(yǎng)24～48 h。取出小室，吸掉培養(yǎng)液，去掉未穿過膜的細胞，多聚甲醛固定，考馬斯亮藍染劑染色30 min。顯微鏡下隨機選取5個高倍視野計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)。

1.2.5 Real-time PCR引物序列 U6：5'-TATTGCTT AAGAATACGCGGTAGAAA-3'；miR-520d-5P：5'-CAC ATTCTCTCAACCTATAATT-3'。

95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸34 s，40個循環(huán)，應(yīng)用ABI7500定量PCR儀進行RT-PCR實驗，檢測各模版的Ct值，所有實驗均重復(fù)3次，陰性對照以DNase/RNase-free H2O為模版。以Folds=2-ΔΔCt表示實驗組與對照組目的基因表達的倍比關(guān)系，公式如下：ΔΔCt=［Ct（CTHRC1）-Ct（GAPDH）］實驗組-［Ct（CTHRC1）］-［Ct（GAPDH）］對照組，重復(fù)3次實驗，計算平均值。

1.2.6 CTHRC1相關(guān)miRNA的篩選和鑒定 1）以CTHRC1為檢索詞，在miRDB、miRanda和miRWalk等數(shù)據(jù)庫中進行目標(biāo)miRNA的靶向預(yù)測，選取上述數(shù)據(jù)庫的預(yù)測結(jié)果交集，即預(yù)測得到可信度和準(zhǔn)確性較高的靶向miRNA；2）擴增包括miR-520d-5p結(jié)合位點的CTHRC1 3'UTR基因片段（Wt CthrcI-3'UTR），并與pmirGLO雙熒光素酶載體連接，同時將基因CTHRC1 3'UTR片段上的miR-520d-5p結(jié)合位點進行定點突變，制成相應(yīng)基因片段（Mut Cthrcl-3'UTR）。應(yīng)用熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-520d-5p與基因CTHRC1 3'UTR的結(jié)合。

1.2.7 miRNA的模擬類似物mimics及抑制物inhibitor的瞬時轉(zhuǎn)染 在50 μL的減血清培養(yǎng)基（Opti-MEM）或其他無血清培養(yǎng)基加入20 pmoL的mimics或inhibitor混勻。采用50 μL Opti-MEM稀釋1 μL Lipofectamin試劑并混勻，室溫放置5 min。將稀釋好的mimics或inhibitor和Lipofectamin試劑混合，室溫放置20 min形成mimics（inhibitor）/Lipofectamin復(fù)合物。將100 μL上述混合物加入含有細胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中混勻。

miR-520d-5p的mimics和inhibitor序列如下：HasmiR-520d-5p mimics sense：5'-CUCUAGAGGGAAGCA CUUUCUG-3'；Anti-sense：5'-GAAAGUGCUUCCCUCU AGAGUU-3'；Has-miR-520d-5p mimics NC sense：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'；Anti-sense：5'-ACG UGACACGUUCGGAGAATT-3'；Has-miR-520d-5p inhi bitor：5'-CAGAAAGUGCUUCCCUCUAGAG-3'；HasmiR-520d-5p mimics NC：5'-CAGUACUUUUGUGUAG UACAA-3'。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。以Western blot檢測結(jié)果采用配對樣本t檢驗；CCK8實驗結(jié)果的交互效應(yīng)采用析因設(shè)計資料的方差分析，組間比較分別采用單向方差分析和獨立樣本t檢驗；Transwell小室細胞運動實驗結(jié)果組間比較分別采用單向方差分析和獨立樣本t檢驗；取α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-520d-5P與基因CTHRC1在結(jié)直腸癌組織中的表達趨勢

本課題組前期在42對配對結(jié)直腸癌及正常組織樣本中發(fā)現(xiàn)，miR-520d-5P在腫瘤組織中表達低于正常組織，而基因CTHRC1在腫瘤組織中蛋白表達水平高于正常組織，兩者呈負相關(guān)［6］。本研究再次收集的23對配對結(jié)直腸癌樣本中得到類似結(jié)果。將兩個中心的數(shù)據(jù)合并分析發(fā)現(xiàn)，在總數(shù)65對樣本中仍然得到類似結(jié)果。正常組織中miR-520d-5P的表達水平高于配對腫瘤組織（t=-2.41，P=0.019），而CTHRC1在腫瘤組織中的表達量則高于正常組織（t=3.83，P=0.001），根據(jù)Spearman曲線結(jié)果顯示兩者呈負相關(guān)（r=-0.567，P＜0.001，圖1）。

2.2 基因CTHRC1與miR-520d-5P在結(jié)直腸癌細胞中的調(diào)控關(guān)系

本研究發(fā)現(xiàn)基因CTHRC1可能為miR-520d-5P的下游靶基因，為了驗證兩者之間表達趨勢負相關(guān)的內(nèi)在機制，采用瞬轉(zhuǎn)的方法將miR-520d-5P類似物轉(zhuǎn)入SW480細胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因CTHRC1蛋白表達水平的下調(diào)，（1.46±0.43）vs.（0.69±0.18），P=0.037。反之miR-520d-5P抑制物干擾miR-520d-5P，基因CTHRC1蛋白表達水平則出現(xiàn)上調(diào)，（0.78±0.22）vs.（1.76±0.33），P=0.032，提示基因CTHRC1受到miR-520d-5P的調(diào)控（圖2A，B）。進而利用HEK293T細胞進行熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-520d-5P是否直接作用于基因CTHRC1的3'UTR區(qū)。將野生型CTHRC1-3'UTR與miR-520d-5P預(yù)測結(jié)合位點突變型CTHRC1-3'UTR分別與報告基因融合并轉(zhuǎn)入HEK293T，并同時加入miR-520d-5P類似物或?qū)φ辗肿舆M行共轉(zhuǎn)染。結(jié)果顯示，野生型CTHRC1-3'UTR共轉(zhuǎn)miR-520d-5P類似物后熒光素活性下降（P＜0.001），但突變型CTHRC1-3'UTR未明顯受到miR-520d-5P類似物的影響（圖2C），提示CTHRC1是miR-520d-5P的直接靶基因。

2.3 基因CTHRC1對結(jié)直腸癌細胞增殖和侵襲能力的影響

采用Western blot法在SW480、SW620、HCT116、LS174、HT29和LOVO結(jié)直腸癌細胞株中檢測基因CTHRC1的蛋白表達水平。結(jié)果顯示，SW480中基因CTHRC1的表達水平低于與其具有同源性的SW620細胞，（1.46±0.21）vs.（5.23±0.03），P=0.001（圖3A）。

應(yīng)用慢病毒系統(tǒng)將基因CTHRC1分別過表達于SW480和SW620細胞中，檢測確認基因CTHRC1的過表達效果（圖3B）。利用CCK8實驗檢測基因CTHRC1對于結(jié)直腸癌細胞增殖能力的影響并繪制生長曲線。結(jié)果顯示，過表達基因CTHRC1使SW480和SW620細胞增殖能力下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3C，D）。

采用Transwell法檢測基因CTHRC1對結(jié)直腸癌細胞體外侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，過表達基因CTHRC1后SW480和SW620侵襲能力提高，且侵襲細胞數(shù)分別在48、72 h檢測時間點差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖3E～G）。

2.4 基因CTHRC1在結(jié)直腸癌組織中對腫瘤組織侵襲浸潤能力的影響

為了明確基因CTHRC1蛋白表達水平與結(jié)直腸癌發(fā)生的相關(guān)性，本研究采用23對結(jié)直腸癌臨床配對樣本對基因CTHRC1蛋白表達水平進行Western blot檢測，結(jié)果經(jīng)配對t檢驗發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織（1.302±1.016）顯著高于正常組織（0.657±0.552），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.003，圖4A，B）。

對臨床結(jié)直腸癌病理樣本進行免疫組織化學(xué)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中基因CTHRC1蛋白表達水平較高的細胞（圖4C，藍色箭頭指示）對于周邊組織表現(xiàn)出典型的侵襲行為（圖4C，紅色箭頭指示），而且部分基因CTHRC1高表達水平的腫瘤細胞出現(xiàn)在血管位置（圖4C，黃色箭頭指示），提示基因CTHRC1表達水平升高促進腫瘤細胞的遠端轉(zhuǎn)移。上述研究結(jié)果表明，基因CTHRC1在結(jié)直腸腫瘤中的表達水平存在異常升高，進而可通過影響腫瘤細胞對周邊組織的侵襲能力促進結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。

圖1 65對結(jié)直腸癌組織及其配對正常組織中CTHRC1與miR-520d-5p的表達水平及關(guān)系

圖2 miR-520d-5P與CTHRC1的調(diào)控關(guān)系

圖3 基因CTHRC1對結(jié)直腸癌細胞侵襲與增殖能力的影響

圖4 基因CTHRC1對腫瘤組織侵襲浸潤能力的影響

3 討論

轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征。在腫瘤轉(zhuǎn)移的初始階段，腫瘤細胞是否可以突破基底膜實現(xiàn)對于周邊組織的侵襲與浸潤對于腫瘤轉(zhuǎn)移具有決定性意義［13］。腫瘤細胞的增殖能力對于腫瘤細胞的體外侵襲檢測會產(chǎn)生一定的影響，即細胞的增殖能力可以通過影響細胞的總數(shù)量間接影響侵襲的細胞數(shù)量。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達基因CTHRC1抑制腫瘤細胞的增殖能力，基因CTHRC1可能對于腫瘤細胞侵襲能力具有促進作用，而且有研究［14］指出，轉(zhuǎn)移癌尤其是腹膜轉(zhuǎn)移癌結(jié)直腸癌細胞的增殖受到抑制。

良性與惡性腫瘤的差異通常表現(xiàn)為是否具有侵襲能力，惡性腫瘤對于周邊正常組織器官的侵襲程度可以直接影響腫瘤分期［3］。本研究結(jié)果顯示，在結(jié)腸癌細胞株SW480與SW620中外源過表達過表達基因CTHRC1可以促進腫瘤細胞的體外侵襲能力，表明基因CTHRC1對于結(jié)直腸癌的惡性程度具有重要影響。腫瘤細胞的侵襲能力與增殖能力對于腫瘤的發(fā)展過程至關(guān)重要，但是由于侵襲與增殖分別促進腫瘤細胞離開原發(fā)部位和建立克隆性占位的不同過程，這兩類特性從基因表達調(diào)控與能量代謝分配的角度分析通常不表現(xiàn)在腫瘤發(fā)展過程中的同一個時間、空間節(jié)點［13］。來自膠質(zhì)母細胞瘤研究的報道［15］表明，高侵襲能力細胞系U87R4相對于低侵襲能力細胞系U87L4具有更強的成瘤能力以及化療抗性，但是在增殖能力方面U87R4弱于U87L4，提示基因CTHRC1表達水平的上升對于調(diào)控腫瘤細胞在脫離原位過程中的侵襲與增殖能力的變化可能存在關(guān)鍵性的影響。

基因CTHRC1的異常高表達與多種癌癥的相關(guān)性已有報道，且大多與癌組織的浸潤和遷移有關(guān)［9］。胃癌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)基因CTHRC1在胃癌細胞中的表達上調(diào)能夠促進胃癌細胞的浸潤和遷移［7］。Ip等［16］研究發(fā)現(xiàn)，基因CTHRC1在非浸潤型黑色素瘤原發(fā)癌組織中的含量遠低于浸潤型黑色素瘤的原發(fā)癌組織，而在黑色素瘤的轉(zhuǎn)移組織中CTHRC1的表達量高于黑色素瘤的原發(fā)癌組織。本課題組的前期研究結(jié)果表明［8］，伴有腹膜轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌原發(fā)癌組織中基因CTHRC1的蛋白表達高于不伴腹膜轉(zhuǎn)移的原發(fā)癌組織，且高表達基因CTHRC1的結(jié)直腸癌患者預(yù)后較差。在本研究中，基因CTHRC1被證明可以通過促進腫瘤細胞的侵襲能力，影響腫瘤的惡性程度。

諸多研究表明，腫瘤微環(huán)境對腫瘤細胞的生長、生存、浸潤和轉(zhuǎn)移有著密切的影響。改變腫瘤微環(huán)境可以使得腫瘤細胞更易從原發(fā)灶脫離進入循環(huán)系統(tǒng)，進而促進癌細胞的轉(zhuǎn)移［17］?；駽THRC1對應(yīng)的蛋白是一種分泌型蛋白［18］，根據(jù)本研究結(jié)果推測，在結(jié)直腸癌形成的過程當(dāng)中，轉(zhuǎn)移性腫瘤細胞高表達基因CTHRC1，并且分泌到細胞外間質(zhì)中，大量CTHRC1蛋白改變腫瘤微環(huán)境，促進癌細胞的浸潤、生存和遷移?；诖耍蓪⒒駽THRC1作為潛在的腫瘤診斷基因靶點對腫瘤的轉(zhuǎn)移潛能進行預(yù)測，進一步設(shè)計小分子化合物中和腫瘤微環(huán)境中的CTHRC1蛋白，可能在一定程度上增強對腫瘤轉(zhuǎn)移行為的控制。

本研究證實基因CTHRC1在結(jié)直腸癌具有轉(zhuǎn)移潛能的細胞中異常高表達?；駽THRC1的過表達提高了結(jié)直腸癌細胞的遷移能力，同時抑制了腫瘤細胞的增殖；而miR-520d-5p對基因CTHRC1的表達具有直接的抑制作用。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多基因、多信號通路共同作用的結(jié)果，因此亟需大量實驗證明在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中與基因CTHRC1相關(guān)的信號通路或關(guān)鍵因子。本研究為探索結(jié)直腸癌侵襲與轉(zhuǎn)移的機制提供了新的視角，以期為深入理解結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機制和尋找新的治療靶點奠定基礎(chǔ)。