萊菔硫烷對過氧化氫誘導(dǎo)人臍靜脈血內(nèi)皮細胞損傷的保護作用及機制研究

康小榮，張明升，秦綱

萊菔硫烷作為異硫氰酸鹽類化合物，因具有抗氧化、抑制腫瘤、心血管保護等治療作用，再加上蔬菜西蘭花中含量豐富，近年來成為國內(nèi)外研究熱點。研究顯示，萊菔硫烷本身并不直接參與抗氧化反應(yīng)，它與谷胱甘肽和蛋白巰基反應(yīng)，通過間接途徑激活Nrf2，誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列二相酶和抗氧化酶實現(xiàn)抗氧化作用[1]。因此萊菔硫烷對氧化損傷的內(nèi)皮細胞可能也有保護作用，但相關(guān)報道尚不多見。本實驗以H2O2干預(yù)人臍靜脈血內(nèi)皮細胞（HUVEC）建立氧化應(yīng)激模型，旨在明確萊菔硫烷對氧化損傷的內(nèi)皮細胞是否具有保護作用，并進一步探討其可能機制，為探討萊菔硫烷的心血管保護作用提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑實驗對象來源于人臍靜脈血內(nèi)皮細胞株HUVEC（中科院細胞庫）。胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司）。含0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、青鏈霉素混合液、二甲基亞砜（DMSO）、噻唑藍（MTT）粉、PBS粉（北京索萊寶生物科技公司)。萊菔硫烷、過氧化氫（美國sigma公司）。DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）。ROS檢測試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。YBR Green PCR 試劑盒（KAPA Biosystems）。TRIzol試劑（ambion）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）。DNaseⅠ（Fermentas）。SMATB全自動酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）。流式細胞儀（BECKMAN公司）。熒光定量PCR儀（Real-Time System）。PCR 儀（T100-Thermal Cycler）。水平電泳設(shè)備（DYC-31D）。凝膠成像系統(tǒng)（Universal Hood Ⅱ）。

1.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組復(fù)蘇凍存的HUVEC，培養(yǎng)液是含10%的胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的高糖DMEM，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細胞至80%融合度時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代。實驗分組：①空白對照組（對照組）：細胞正常培養(yǎng)2.5 h；②過氧化氫組（H2O2組）：分別給予100、200、400、600、800 μmol/L濃度培養(yǎng)細胞2 h，選擇400 μmol/L為其最佳干預(yù)濃度（后續(xù)各組如未特殊注明，默認(rèn)H2O2濃度為400 μmol/L）；③萊菔硫烷+過氧化氫組（SFN+H2O2組）：不同濃度SFN（2.5、5、10 μmol/L）預(yù)孵育30 min后，加入400 μmol/L的H2O2繼續(xù)培養(yǎng)2 h。

1.3 MTT法測定HUVEC細胞活性HUVEC按4×103/ml密度接種到96孔板，每孔200 μl。待細胞生長融合達80%后，分別依照實驗分組干預(yù)2.5 h，每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/m1），繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO（二甲基亞砜）150 μl，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。使用全自動酶標(biāo)儀，測定并記錄各孔在波長為570 nm處的吸光光度值（A值），設(shè)對照組HUVEC的細胞活性為100%，實驗組A值/對照組A值表示其活性。

1.4 流式細胞儀測定細胞內(nèi)ROS水平細胞按1×105個/ml密度接種于6孔板，每孔1 ml。收集各組細胞，去除培養(yǎng)基，細胞收集后懸浮于濃度為10 μmol/L的DCFH-DA探針中，使細胞濃度為 1×107/ml，繼續(xù)孵育20 min，每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。然后用無血清培養(yǎng)基洗滌3次，流式細胞儀測定并記錄各樣本的ROS相對水平。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR法）測定Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平細胞按2×105個/ml密度接種于6個小培養(yǎng)皿，每孔2 ml。收集各組細胞，用TRIzol提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA并擴增目的基因，設(shè)β-actin為內(nèi)參照。Nrf2引物序列為5＇-GGTAAGAATAAAGTGGCT-3＇和5＇-TTGTTTTTTCAGTAGGTG-3＇；HO-l引物序列為5＇—TTCAGAAGGGTCAGGTGT-3＇和5＇-AGTAGAGTGGGGCATAGA-3＇；β—actin引物序列為5＇-CCACTCCTCCACCTTTG-3＇和5＇-CACCACCCTGTTGCTGT-3＇。各引物序列用Qbase plus軟件設(shè)計。總RNA（500 ng）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，建立20 μl反應(yīng)體系，42℃孵育60 min，70℃孵育15 min，16℃，保持；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆?。將制備好的cDNA進行PCR擴增，建立20 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95℃，3 min預(yù)變性；95℃，5 sec變性；56℃，10 sec退火；72℃，25 sec延伸；39 個循環(huán)；65℃，5Sec；95℃，50 Sec。擴增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳，用Universal Hood II凝膠成像系統(tǒng)成像，記錄并用△△Ct法計算Nrf2、HO-1基因的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用（±s）表示。經(jīng)正態(tài)分布檢驗、方差齊性檢驗后，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H2O2作用于HUVEC細胞后細胞存活率下降，SFN預(yù)處理后逆轉(zhuǎn)H2O2對HUVEC細胞存活率的影響H2O2100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L和800 μmol/L組的細胞活性依次為對照組的96.5%、84.4%、61.4%、58.0%和54.4%（P＜0.05），選擇400 μmol/L為其有效干預(yù)濃度（后續(xù)各組如未特殊注明，默認(rèn)H2O2濃度為400 μmol/L）。SFN 2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L單獨作用后各組細胞活性依次為對照組的98.2%、93.1%、89.0%（P＜0.05）。SFN 2.5、5、10 μmol/L預(yù)孵育30 min后加入H2O2，各組細胞活性依次為對照組的69.4%、82.9%、86.9%（與H2O2組比較，P＜0.05）（圖1）。

2.2 SFN預(yù)處理后減少H2O2所致HUVEC細胞內(nèi)ROS生成H2O2100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L和800 μmol/L組的ROS水平依次為對照組的為1.25、3.45、6.71、6.78、6.78（P＜0.05）。SFN 2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L預(yù)孵育30 min后加入H2O2，各組細胞ROS水平依次為H2O2組的0.82、0.74、0.50（P＜0.05）（圖2）。

2.3 SFN預(yù)處理后逆轉(zhuǎn)H2O2所致HUVEC細胞Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平H2O2100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、600 μmol/L和800 μmol/L組的Nrf2 mRNA水平依次為對照組的0.86、0.40、0.32、0.14、0.05（P＜0.05），HO-1 mRNA水平依次為對照組的為0.92、0.40、0.27、0.17、0.09（P＜0.05）。SFN 2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L預(yù)孵育30 min后加入H2O2，各組細胞Nrf2 mRNA水平依次為H2O2組的1.10、1.39、2.05（P＜0.05），HO-1 mRNA水平依次為H2O2組的1.58、1.74、1.97（P＜0.05）（圖3）。

圖1 MTT法檢測各組細胞活性的結(jié)果

圖2 流式細胞儀檢測各組細胞ROS相對水平

圖3 RT-PCR法檢測各組細胞Nr f2 mRNA、HO-1mRN相對水平的結(jié)果

3 討論

流行病學(xué)研究表明，萊菔硫烷攝入量與心血管疾病風(fēng)險降低有關(guān)[2]。實驗觀察到SFN可以降低自發(fā)性高血壓性卒中大鼠腦動脈的氧化應(yīng)激和炎癥[3]。在健康志愿者的實驗中，血漿中的SFN可以被迅速消除，但它誘導(dǎo)抗氧化酶產(chǎn)生使得血管生理效應(yīng)可以延長到24 h[4]。動物和人體實驗都證實了SFN對心血管疾病的保護作用，包括高血壓、動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注、糖尿病及糖尿病并發(fā)癥等[5]。本研究從體外培養(yǎng)人臍靜脈血內(nèi)皮細胞，建立內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激模型，探討萊菔硫烷對氧化損傷的內(nèi)皮細胞是否也有保護效應(yīng)。

血管內(nèi)皮細胞合成并釋放多種生物活性分子，調(diào)節(jié)血管擴張與收縮、溶解血栓，維持血管壁內(nèi)部穩(wěn)態(tài)。血管內(nèi)皮功能障礙導(dǎo)致一氧化氮生物利用度降低和心血管疾病的發(fā)生，是動脈粥樣硬化發(fā)病的第一步[6]。內(nèi)皮功能障礙與常見疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)，氧化應(yīng)激、缺氧和血流紊亂是與內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的重要因素[7]。

H2O2作為一種機體產(chǎn)生的活性氧（ROS），低濃度時可作為信號分子調(diào)節(jié)基因表達和信號傳導(dǎo)，高濃度的H2O2則會引起氧化應(yīng)激[8]。以H2O2干預(yù)人臍靜脈血內(nèi)皮細胞（HUVEC）建立氧化應(yīng)激模型[9]，通過MTT法和流式細胞儀分別檢測HUVEC中的細胞活性和ROS表達水平。實驗結(jié)果顯示：隨著過氧化氫濃度升高，細胞活性逐步降低，ROS表達水平逐漸升高，這表明H2O2濃度依賴性地?fù)p傷內(nèi)皮細胞，并且證明氧化應(yīng)激是損傷內(nèi)皮細胞的可能機制之一。SFN預(yù)處理細胞后，隨著SFN濃度升高，被H2O2抑制的細胞活性升高，ROS表達水平降低，這提示萊菔硫烷可以對抗內(nèi)皮細胞損傷，這種作用可能與其抗氧化和抗炎作用有關(guān)，而且SFN的這種保護作用呈濃度依賴性。

生理條件下機體抗氧化防御機制包括多種活性氧清除酶、Ⅱ相解毒酶及其他抗氧化劑，每種抗氧化劑在其啟動子區(qū)域都有細胞核結(jié)合抗氧化元件（ARE）。Nrf2作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控多種ARE途徑控制一系列下游靶基因，包括血紅素氧合酶-1（HO-1）、醌氧化還原酶-1（NQO1）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）和硫氧還蛋白（TRX），在ROS損傷細胞過程起著重要作用[10]，起到減少細胞凋亡，延緩衰老和減少器官損傷等多方面的作用[11]。小鼠實驗證明，Nrf2表達增加使得Ⅱ相解毒酶活性增強，間接保護氧化低密度脂蛋白介導(dǎo)的巨噬細胞損傷，而Nrf2表達減少增加泡沫細胞形成和促進動脈粥樣硬化[12]。同時還有研究表明，Nrf2的下游靶基因HO-1通過降低氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)單核細胞再生抑制動脈粥樣硬化形成，在抗動脈粥樣硬化過程起著至關(guān)重要的作用[13]。

本實驗以RT-PCR法檢測HUVEC中的Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平。低水平的氧化應(yīng)激會激活細胞自身抗氧化機制，刺激Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平增高，對內(nèi)皮細胞有保護作用。實驗結(jié)果顯示，高濃度H2O2作用于細胞后，Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平顯著降低，提示高濃度H2O2對細胞整體的損傷作用超過了其自身保護機制。在使用SFN預(yù)處理后，較H2O2損傷的細胞，細胞活性升高，ROS水平下降，Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達水平明顯提高，且呈明顯濃度依賴性，提示SFN可以通過激活Nrf2/HO-1途徑增強細胞抗氧化損傷的作用。

綜上所述，本實驗初步探討了SFN對H2O2致HUVEC損傷的保護作用，提示一定范圍內(nèi)SFN對內(nèi)皮細胞的抗氧化損傷作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，SFN在轉(zhuǎn)錄水平激活Nrf2/HO-1途徑在這一過程中起到了關(guān)鍵作用，為利用SFN對心血管疾病進行治療提供了基礎(chǔ)實驗和理論依據(jù)。但Nrf2/HO-1信號通路蛋白表達水平如何以及SFN是否還通過其他途徑對抗細胞損傷，還需要進一步探討。