酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性及穩(wěn)定性研究

戴梓茹，農(nóng)月睿，黃巧，張晨曉，李瑩，覃楨杰

（1.廣西高校北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點實驗室，廣西欽州535011；2.欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，廣西欽州535011）

酸楊桃是楊桃的一種，偏酸味，種植于熱帶亞熱帶地區(qū)，四季帶果，產(chǎn)量大，營養(yǎng)豐富，具有生津止渴、保肝、降糖等功用[1-4]。目前對于楊桃的研究和加工多是甜味品種的楊桃，包括果樹培育、保鮮、果汁加工等[5-10]。而酸楊桃味道較酸，人們甚少鮮食。酸楊桃發(fā)酵液是兩廣地區(qū)人們用鹽制浸泡自然發(fā)酵的方法制備的傳統(tǒng)地方性日用飲料，對腸胃熱、咽喉痛、牙痛、消炎降火等具有特別的調(diào)理功效，浸泡后的果實可用作烹調(diào)調(diào)味料、日常小零食等。由于酸楊桃發(fā)酵液口感偏酸咸，其特殊功效缺乏科學(xué)數(shù)據(jù)支持，致使酸楊桃發(fā)酵飲料難以推廣。本研究采用牛津杯法測定了酸楊桃發(fā)酵液對李斯特菌、大腸桿菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌5種供試菌的抑菌活性，同時以原液稀釋液為樣本，確定其最小抑菌濃度，并對酸楊桃發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)進行了初步研究，為酸楊桃的精深加工和產(chǎn)品推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸楊桃：采集于廣西博白；氫氧化鈉（分析純）：江西景泰設(shè)備有限公司；鹽酸（分析純）：成都市科龍化工股份有限公司；氯化鈉（分析純）：廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；營養(yǎng)瓊脂（生物試劑）、細菌學(xué)蛋白胨（生物試劑）、牛肉浸膏（生物試劑）、瓊脂粉（生物試劑）：山東梁山科鑫生物制品有限公司；胰蛋白酶（5 000 U/g）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酸性蛋白酶（50 000 U/g）、中性蛋白酶（50 000 U/g）、堿性蛋白酶（50 000 U/g）：南寧市東恒華道生物科技有限公司；李斯特菌（G+）、大腸桿菌（G-）、大腸桿菌 O157（G-）、金黃色葡萄球菌（G+）、蠟樣芽孢桿菌（G+）：由欽州學(xué)院北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點實驗室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金怡儀器科技有限公司；SO510C立式壓力蒸汽滅菌器：重慶雅馬拓科技有限公司；BCD-575WDBI立式冰箱：青島海爾股份有限公司；Medium超純水機：上海和泰儀器有限公司；LHS-150HC-II恒溫恒濕箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；C20-HK2002E多功能電磁爐：廣東美的生活電器制造有限公司；GZX-DH.500-BS型電熱恒溫干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；B型玻璃儀器氣流烘干器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；ME204E/02電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PHS-3EpH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 酸楊桃發(fā)酵液制備

1）樣品準(zhǔn)備：按照比例（960 mL無菌水，400 g酸楊桃，50 g食鹽）將各種原材料及配料加入滅菌的發(fā)酵罐中，發(fā)酵3周，將酸楊桃發(fā)酵液取出，過濾，得到酸楊桃發(fā)酵液原液，并用無菌水稀釋成不同的濃度梯度，冷藏于無菌離心管中，備用。

2）食鹽水對照：按比例（960 mL無菌水，50 g食鹽）保存3周后，其余操作同（1），獲得5%食鹽水對照。

1.4 酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性研究

1.4.1 菌種活化及菌液制備

1.4.1.1 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水 1 000 mL，pH 7.2～7.4。

營養(yǎng)瓊脂：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水 1 000 mL，pH 7.2～7.4，瓊脂 17 g。

2%水瓊脂：20 g瓊脂粉加入1 000 mL水中，加熱溶化后，于121℃滅菌15 min。

1.4.1.2 菌液制備

菌種傳代培養(yǎng)：取適量菌種，接種到試管固體斜面培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)24 h，室溫放置4 h，置于4℃冰箱保存。

供試菌菌懸液制備：挑取單一菌落接種到液體培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)12 h，以1%的接種量傳代培養(yǎng)一次后，用生理鹽水（0.85%）進行10倍梯度稀釋，選取10-3倍稀釋液為試驗用的菌懸液。

1.4.2 酸楊桃發(fā)酵液抑菌試驗

選取牛津杯法測定酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性。在平板中加入10 mL水瓊脂，待其凝固后，用鑷子將滅菌后的牛津杯置于素瓊脂上（每個平板可放置4個牛津杯）。將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂冷卻到40℃，以2%的接種量加入菌懸液，混勻后倒約25 mL于水瓊脂層上（注意不要倒入牛津杯小孔中），待其凝固后，在一個牛津杯小孔中加入0.2 mL的對照溶液（無菌水或5%食鹽水），其余3個牛津杯小孔中加入0.2 mL的酸楊桃發(fā)酵液樣品。在37℃下正置培養(yǎng)24 h后，觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)，若出現(xiàn)抑菌圈，再用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。

1.5 酸楊桃發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性研究

1.5.1 pH值對酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性的影響

測定得知酸楊桃發(fā)酵液pH值為1.8，按照步驟配制以下溶液：1）配制與酸楊桃發(fā)酵液pH值相同的鹽酸溶液25mL；2）分別取10mL的酸楊桃發(fā)酵液于50mL的燒杯中，向燒杯加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為3、4、5、6、7。將以上溶液與酸楊桃發(fā)酵液原液作為試驗組，以濃度為5%的食鹽水作為對照組進行試驗，探討pH值對酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性的影響。

1.5.2 溫度對酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性的影響

取3支試管分別加入10 mL酸楊桃發(fā)酵液，將3支試管分別置于40、60、100℃的水浴鍋中水浴加熱1 h～4 h。將3個溫度處理的鹽制酸楊桃溶液作為試驗組，未經(jīng)處理的酸楊桃發(fā)酵液原溶液作為空白對照進行抑菌試驗。

1.5.3 酶處理對酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性的影響

取3個250 mL的燒杯分別向其中加入100 mL的酸楊桃發(fā)酵液溶液，再分別向3個燒杯中加入楊桃水質(zhì)量0.1%～0.2%的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶3種酶液，然后將3個燒杯置于50℃的水浴鍋中水浴加熱4 h，95℃下水浴加熱滅酶15 min。將處理過的樣本作為試驗組，未經(jīng)處理的酸楊桃發(fā)酵液原溶液作為空白對照進行抑菌試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸楊桃發(fā)酵液對5種供試菌的抑菌活性

酸楊桃發(fā)酵液對5種指示菌的抑制作用及其最小抑菌濃度結(jié)果見表1。

表1 酸楊桃發(fā)酵液對5種供試菌的抑菌活性Table 1 Bacteriostatic activity of sour carambola fermentation liquid with five bacteria

由表1可知，酸楊桃發(fā)酵液對李斯特菌、大腸桿菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌均有良好的抑菌作用，抑菌圈直徑分別達到20.06、23.79、25.19、22.21、21.66 mm，最小抑菌濃度分別為 9、15、15、12、12 倍原液稀釋液。

2.2 pH值對酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性的影響

測定得知酸楊桃發(fā)酵液原液的pH值為1.8。試驗選擇金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為供試菌，以濃度為5%的食鹽水和與pH值為1.8的鹽酸作為對照，依次測定pH值調(diào)至3、4、5、6、7的酸楊桃發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用，結(jié)果見表2。

由表2可知，隨著pH值的升高，酸楊桃發(fā)酵液抑菌效果逐漸降低，當(dāng)pH≥6時，抑菌作用消失。濃度為5%的食鹽水及pH值為6的酸楊桃汁兩者沒有抑菌作用。pH1.8的鹽酸對兩種指示菌具有抑制作用，但其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為12.77、12.30 mm，明顯小于酸楊桃發(fā)酵液抑菌圈直徑。因此，可知酸楊桃發(fā)酵液在較強酸性環(huán)境中的抑菌效果較好，堿性條件下，抑菌作用逐漸減弱甚至抑菌活性消失，這與雪松松針提取物、甜葉菊廢渣提取物的抑菌穩(wěn)定性研究結(jié)果一致[11-12]，分析原因，可能是堿性環(huán)境導(dǎo)致酸楊桃發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使抑菌效果減弱或消失。

表2 pH值對酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性的影響Table 2 Effect of bacteriostatic activity of sour carambola fermentation liquid by pH

2.3 溫度處理對酸楊桃發(fā)酵液抑菌效果的影響

以大腸桿菌為指示菌，酸楊桃發(fā)酵液原液為對照，置于40、60、100℃水浴處理1 h～4 h的酸楊桃發(fā)酵液為試驗樣本，檢測其抑菌效果，結(jié)果見表3。

表3 溫度處理對酸楊桃發(fā)酵液抑菌效果的影響Table 3 Effect of bacteriostatic activity of sour carambola fermentation liquid by temperature

由表3可知，不同處理溫度和不同處理時間處理過的酸楊桃發(fā)酵液之間抑菌作用沒有顯著變化，且與酸楊桃汁發(fā)酵液原液的抑菌效果無顯著性差異。因此，可以推斷酸楊桃發(fā)酵液的抑菌活性物質(zhì)具有良好的耐熱性。

2.4 酶處理對酸楊桃發(fā)酵液抑菌效果的影響

以大腸桿菌為指示菌，酸楊桃發(fā)酵液原液為對照，酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶處理的酸楊桃發(fā)酵液為試驗樣本，檢測其抑菌活性，結(jié)果見圖1。

圖1 酶處理對酸楊桃發(fā)酵液抑菌效果的影響Fig.1 Effect of bacteriostatic activity of sour carambola fermentation liquid by enzyme

如圖1所示，3種蛋白酶處理后，抑菌圈直徑分別為23.17、23.88、23.53 mm，酶處理后的酸楊桃發(fā)酵液抑菌活性與酸楊桃發(fā)酵原液的抑菌活性無顯著差異，由此可推斷，酸楊桃發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)是非蛋白類物質(zhì)。

3 結(jié)論

本文采用牛津杯法測定了酸楊桃發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性，同時確定了對不同指示菌的最小抑菌濃度，并通過研究pH值、溫度以及酶處理對抑菌活性的影響，初步確定了酸楊桃發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的特性。研究表明酸楊桃發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌都有良好的抑菌活性，抑菌圈直徑分別為 20.06、23.49、25.19、22.50、21.56 mm，最小抑菌濃度分別為酸楊桃發(fā)酵液原液9倍～15倍稀釋液。酸楊桃發(fā)酵液隨pH值升高，抑菌活性逐漸降低，當(dāng)pH＞6時抑菌活性消失，溫度及蛋白酶對酸楊桃發(fā)酵液的抑菌效果沒有顯著影響，可以推斷酸楊桃發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)可能是一類耐高溫的非蛋白類的酸性物質(zhì)。因此，將酸楊桃發(fā)酵液作為酸性環(huán)境下的具有良好耐熱性的非蛋白類天然防腐劑具有廣闊的前景。本研究主要對酸楊桃發(fā)酵液的抑菌作用及抑菌性質(zhì)作了部分基礎(chǔ)性的研究，研究工作還不夠透徹和全面，還存在一些尚待改進的工作。后續(xù)研究可對酸楊桃發(fā)酵液中的抑菌成分進行分離鑒定，并通過體內(nèi)動物實驗進一步闡明其抑菌機制，為酸楊桃多功能開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。