周 勇，史玉恒，范玉頂，劉文枝，江 南，趙建青，許 晨，曾令兵

(中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢430223)

鯽(Carassiusauratus)是我國重要的淡水養(yǎng)殖品種。據統(tǒng)計，2016年全國鯽養(yǎng)殖產量為300.52萬t，約占全國淡水魚養(yǎng)殖產量的10.67%[1]。由于鯽養(yǎng)殖規(guī)模的擴大，集約化程度的提高以及養(yǎng)殖水環(huán)境的惡化，鯽的病害問題日益突出，給鯽養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經濟損失。由鯉皰疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)感染養(yǎng)殖鯽引起的造血器官壞死癥是我國新出現(xiàn)的一種病毒性疾病，其傳染性強，死亡率高，危害嚴重[2，3]。

CyHV-2，又稱為皰疹病毒性造血器官壞死癥病毒(HVHNV)(Jung et al，1995)或金魚(C.auratusauratus)造血器官壞死癥病毒(GFHNV)(Groff et al，1998)，屬異皰疹病毒科(Alloherpesviridae)鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)成員(Davison et al，2009)。1992年，首次從日本患病金魚組織內分離到CyHV-2，其致死率達100%[4]。隨后陸續(xù)在亞洲、美洲、澳洲、歐洲的患病金魚組織中檢測到該病毒[5]。2011年首次在匈牙利養(yǎng)殖鯽組織內分離出CyHV-2，隨后多國暴發(fā)了由該病毒引起鯽大量死亡的事件[6-8]。自2012年起，CyHV-2已在我國多個省市報道檢出，其傳播呈快速擴散的趨勢[9]。

目前，針對CyHV-2感染尚無有效的防治藥物。因此，研制有效的診斷試劑和疫苗，無疑有助于鯽造血器官壞死癥的診斷和防控。本研究利用生物軟件分析CyHV-2 ORF25編碼蛋白的抗原表位，選取富含抗原表位的區(qū)域進行原核表達截短蛋白，將表達產物純化后免疫日本大耳兔制備抗CyHV-2多克隆抗體，同時將純化的截短蛋白免疫鯽，通過免疫保護實驗研究截短表達蛋白的免疫原性，以期為抗CyHV-2新型疫苗的創(chuàng)制和CyHV-2免疫檢測試劑盒的研發(fā)奠定前期基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

實驗用異育銀鯽來自于中國水產科學研究院長江水產研究所窯灣試驗基地，平均體重(158±18)g。暫養(yǎng)于室內循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，水溫控制在(24±2)℃，連續(xù)充氣增氧，投喂商品化配合飼料。實驗前隨機抽取部分鯽進行CyHV-2檢測，確定魚體不帶有CyHV-2后用于試驗。

1.2 病毒株、細胞系、菌株與質粒

CyHV-2分離于江蘇某養(yǎng)殖場患病異育銀鯽，由本實驗室分離鑒定與保藏[2]。異育銀鯽腦組織細胞系(GiCB)由本實驗室建立并保存[10]，培養(yǎng)基為含10% 新生牛血清的M199，培養(yǎng)溫度為28 ℃。E.coilDH5α菌株、E.coilBL21(DE3)菌株和克隆載體pMD19-T購置于TaKaRa公司；表達載體pET32a+ 購置于Novagen公司。

1.3 CyHV-2 ORF25截短基因的克隆

利用生物信息學軟件DNA Star 6.0(Protean)對CyHV-2(GenBank Access.No.KM200722.1)的ORF25 編碼蛋白進行分析，針對該序列富含抗原表位的一段基因設計引物pET-CyHV-25JD-F：5′-CGGGATCCACTCAGAATACAACA-3′和pET-CyHV-25JD-R：5′-CCAAGCTTGTTTGCGCCGTATGG-3′，上、下游引物酶切位點分別是BamH I和HindⅢ。提取GiCB細胞培養(yǎng)的CyHV-2病毒核酸作為PCR模板進行擴增。擴增程序為：95 ℃預變性 2 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后回收。將回收產物連接到pMD19-T克隆載體后，轉化到E.coilDH5α感受態(tài)細胞中。通過PCR和雙酶切鑒定出陽性重組質粒，命名為pMD19-T-tORF25。

1.4 原核表達載體的構建

用限制性內切酶BamH Ⅰ和HindⅢ分別對重組質粒pMD19-T-tORF25和原核表達載體pET32a+進行雙酶切。將酶切后的目的基因通過瓊脂糖凝膠電泳分離后回收。回收產物經T4 DNA連接酶連接后，轉化到E.coilBL21(DE3)感受態(tài)細胞中。轉化產物經PCR和雙酶切鑒定，陽性重組質粒命名為pET-32a-tORF25，其菌株命名為pET-32a-tORF25/BL21。

1.5 截短表達蛋白的表達與純化

將重組菌pET-32a-tORF25/BL21接種于含0.05 g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。次日將菌體培養(yǎng)物以1∶100的比例接種于LB液體培養(yǎng)基內，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 nm≈0.4，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-B-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達，以不加IPTG的菌液作為陰性對照。誘導4 h后將菌液離心，取部分沉淀進行SDS-PAGE分析。 同時，剩余沉淀經超聲波破碎后，通過His標簽蛋白純化試劑盒(上海，碧云天)純化截短表達蛋白tORF25。采用Bradford法對純化后截短表達蛋白tORF25的濃度進行測定。

1.6 多克隆抗體制備及效價測定

將0.6 mg截短表達蛋白tORF25與等量的弗氏完全佐劑混合后，以皮下多點注射的方式免疫日本大耳兔，陰性對照注射PBS。每間隔14 d加強免疫一次，共免疫5次。在最后一次免疫后第7天采集兔血樣，分離血清。通過抗體親和純化得到純化的多克隆抗體。將純化的多克隆抗體稀釋1×103倍后，再進行2倍等比稀釋至1∶64 000。將稀釋后不同濃度的多克隆抗體轉移至含100 μg/孔截短表達蛋白tORF25的96孔板中孵育，同時設置1×103倍稀釋后的陰性組血清作為陰性對照。將羊抗兔IgG(含HRP標記)加入上述96孔板后，用四甲基苯胺(TMB)溶液顯色。測定各孔的OD450nm值，確定抗體效價。

1.7 Western blot分析

將誘導和未誘導(陰性對照)的重組菌進行SDS-PAGE電泳后，轉至硝酸纖維素膜上。以純化的多克隆抗體為一抗，參照ONE-HOUR WesternTM試劑盒(南京，金斯瑞)操作步驟對多克隆抗體進行Western blot分析。

1.8 間接免疫熒光檢測

用4% 多聚甲醛將感染CyHV-2后出現(xiàn)典型細胞病變效應的GiCB細胞固定。以純化的多克隆抗體為一抗，參照間接免疫熒光試劑盒-抗兔Cy3(上海，碧云天)操作步驟進行間接免疫熒光檢測。

1.9 免疫保護率測定

免疫試驗用異育銀鯽在恒溫循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)7 d后，隨機分為免疫組和對照組，每組30尾魚。將純化的重組蛋白tORF25用PBS稀釋至200 μg/mL。免疫組肌肉注射0.1 mL含有20 μg的截短蛋白tORF25。對照組注射等體積的PBS。接種截短蛋白tORF25后，免疫鯽養(yǎng)殖水溫保持在25 ℃，每天投喂鯽商品飼料。免疫后第21天用濃度為0.1 mg/mL MS-222將魚體麻醉后，通過腹腔注射滴度為100 TCID50/mL的CyHV-2，劑量為0.4 mL/尾。持續(xù)觀察28 d，每天記錄感染后情況，計算出截短表達蛋白tORF25免疫鯽后的相對免疫保護率(RPS)。計算公式為：

RPS=[1-(免疫組死亡率/對照組死亡率)]×100%

1.10 數(shù)據分析

利用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件處理實驗結果。

2 結果

2.1 CyHV-2 ORF25截短蛋白編碼基因的克隆

利用生物軟件對CyHV-2 ORF25蛋白的抗原表位進行分析，結果顯示CyHV-2 ORF25編碼蛋白存在多個抗原表位。針對CyHV-2 ORF25蛋白第20-117位富含抗原表位的氨基酸編碼基因設計引物。從病毒基因組DNA中擴增出大小為294 bp的基因片段，其測序結果與預期結果一致(圖1)。將擴增產物tORF25進行電泳回收后，連接到克隆載體pMD19-T上。連接產物轉化到E.coilDH5α感受態(tài)細胞后，對陽性菌株進行PCR和雙酶切檢測。檢測結果顯示，均在294 bp處有一條特異條帶，與預期的核酸片段大小相同(圖2)。結果表明，已成功構建了重組質粒pMD19-T-tORF25。

圖1 tORF25基因的擴增結果Fig.1 The result of tORF25 gene amplification1：陰性對照；2：tORF25基因；M：DL 2000 DNA Ladder

圖2 重組質粒pMD19-T-tORF25鑒定結果

2.2 重組表達質粒的構建及鑒定

將重組質粒pMD19-T-tORF25和原核表達載體pET32a+雙酶切后，回收并連接目的基因。連接產物轉化到E.coilBL21(DE3)感受態(tài)細胞后，對陽性菌落進行PCR和雙酶切鑒定。電泳結果顯示，均在294 bp處有一條特異條帶，與預期的核酸片段大小相同(圖3)。結果表明，已成功構建了重組表達質粒pET-32a-tORF25，且獲得了含有該質粒的E.coilBL21(DE3)原核表達菌株。

2.3 截短表達蛋白的表達與純化

原核表達菌株經1 mmol/L IPTG誘導4 h后，進行SDS-PAGE電泳。結果顯示，誘導后的原核表達菌株在28 kW處有一條明顯的亮帶，與預期蛋白大小一致，而未誘導的原核表達菌株在28 kW處未見明顯亮帶(圖4)。結果表明，原核表達菌株能有效地表達出截短表達蛋白tORF25。

圖3 重組表達質粒pET-32a-tORF25鑒定結果Fig.3 Identification results of recombinant expression plasmid pET-32a-tORF251：雙酶切；2：未酶切；3：PCR；4：陰性對照；M：DNA Marker DL 2000

圖4 原核表達菌株SDS-PAGE分析Fig.4 The strain analysis of procaryotic expression by SDS-PAGE1-2：未誘導；3-7：誘導；M：蛋白分子標準

利用His標簽吸附作用純化截短表達蛋白，并對純化的產物進行SDS-PAGE電泳鑒定(圖5)。實驗結果表明得到了高純度的截短表達蛋白。經Bradford法測定截短表達蛋白的濃度為600 μg/mL。

圖5 純化后的重組tORF25蛋白Fig.5 Purified recombinant protein tORF251：純化后的截短表達蛋白；2：純化前的截短表達蛋白；M：蛋白分子標準

2.4 截短表達蛋白多克隆抗體的制備及Western blot檢測

收集經過5次免疫的日本大耳兔抗血清，抗血清經抗體親和純化得到多克隆抗體，濃度為6.25 mg/mL。經ELISA法測定，抗體效價大于1∶40 000。Western blot結果表明：多克隆抗體能特異性地結合截短表達蛋白tORF25(圖6)。

圖6 重組tORF25蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of expressed tORF25 protein with the polyclonal antibodies1：誘導；2：未誘導；M：蛋白分子量標準

2.5 間接免疫熒光檢測

感染CyHV-2的GiCB細胞和未處理的正常GiCB細胞經多聚甲醛固定后，依次與多克隆抗體和紅色熒光探針標記的羊抗兔IgG抗體孵育。熒光顯微鏡下觀察顯示，感染CyHV-2的GiCB細胞在綠光激發(fā)下呈現(xiàn)出鮮艷的紅色，而沒有感染CyHV-2的GiCB細胞則沒有紅色熒光出現(xiàn)(圖7)。實驗結果表明，制備的抗截短蛋白tORF25的多克隆抗體能夠用于檢測CyHV-2。

圖7 免疫熒光檢測GiCB細胞中的CyHV-2Fig.7 Detection CyHV-2 in GiCB cells by the immunofluorescenceA：DAPI染色病變細胞；B：熒光顯微鏡下病變細胞；C：A和B融合圖；D：DAPI染色正常細胞；E：熒光顯微鏡下正常細胞；F：D和E融合圖(標尺大?。?0微米)

2.6 免疫保護率

使用截短蛋白tORF25免疫異育銀鯽后，第21天進行攻毒感染試驗。攻毒后，免疫組與對照組鯽在28 d內均出現(xiàn)了不同程度的發(fā)病死亡，發(fā)病時間集中在攻毒后的第10～22天，結果如圖8所示。免疫截短蛋白tORF25后，鯽產生了明顯的免疫力，tORF25截短蛋白免疫試驗組的累計死亡率為46%，而PBS對照組的累計死亡率為87%(圖8)。依據公式計算，免疫截短蛋白tORF25免疫異育銀鯽后的相對免疫保護率為47%。攻毒試驗中，試驗魚發(fā)病死亡的臨床癥狀與自然感染CyHV-2的鯽臨床癥狀一致。采集攻毒實驗中發(fā)病死亡鯽的內臟組織進行PCR檢測，均顯示為CyHV-2陽性，表明其死亡原因是由于人工注射感染CyHV-2所致。

圖8 攻毒后鯽的累計死亡率Fig.8 Cumulative mortality of gibel carp after challenge with live CyHV-2

3 討論

Li等[11]對我國鯽造血器官壞死癥流行株CyHV-2 SY-C1全基因組進行了測序，結果顯示，該病毒由289 365個堿基對組成,G+C含量為51.7%。根據CyHV-2基因組序列預測出該病毒有開放閱讀框約151個，這151個ORF編碼了構成病毒自身所有的結構和功能蛋白[11，12]。其中，CyHV-2的ORF25基因屬于ORF25多基因家族，編碼病毒的膜蛋白，含有免疫球蛋白樣結構域，具有較好的免疫原性[12,13]。本研究通過生物信息學方法，分析了ORF25編碼蛋白的抗原表位，篩選出富含抗原表位的區(qū)域進行原核表達。表達的截短蛋白tORF25由CyHV-2 tORF25截短基因編碼蛋白和載體自身的標簽蛋白組成。

利用原核表達蛋白制備抗體后，驗證抗體與病毒的免疫反應，是建立病毒免疫檢測方法的基本思路。已有研究表明，用原核表達的CyHV-2 ORF4，ORF5和ORF72蛋白制備的多克隆抗體能與CyHV-2發(fā)生特異性反應[14-16]。彭俊杰等[13]用原核系統(tǒng)表達的CyHV-2 ORF25免疫小鼠后，通過細胞融合和ELISA實驗篩選出1株能分泌抗CyHV-2 ORF25編碼蛋白單克隆抗體的細胞株，該細胞株分泌的單克隆抗體能與感染CyHV-2的GiCB細胞發(fā)生特異性結合。本研究用純化的截短表達蛋白tORF25免疫日本大耳兔，成功地制備了抗CyHV-2 ORF25截短基因編碼蛋白的特異性多克隆抗體。將該多克隆抗體與原核表達的tORF25蛋白進行Western blot檢測，結果顯示雜交條帶大小與預期蛋白大小一致，說明該抗體特異性好。將該多克隆抗體與感染CyHV-2后發(fā)生病變的GiCB細胞反應，發(fā)現(xiàn)病毒和抗體能特異性結合，而且結合效率高于CyHV-2 ORF4編碼蛋白制備抗體的結合效率[16]，表明該多克隆抗體可用于CyHV-2的免疫診斷。通過抗ORF25編碼蛋白多克隆抗體建立的CyHV-2間接免疫熒光診斷方法，豐富了CyHV-2的免疫學檢測方法。

廖紅等[15]將原核表達的CyHV-2 ORF5編碼蛋白免疫鯽后，使用CyHV-2進行攻毒試驗，結果顯示表達蛋白的相對免疫保護率最高為35%。而本研究將截短表達蛋白tORF25注射鯽后接種CyHV-2，其相對免疫保護率為47%，高于CyHV-2 ORF5編碼蛋白免疫鯽后的保護率。但對于疫苗產品來說，47%的保護率并不理想，這可能是由于原核表達的蛋白缺少糖基化修飾等原因所致，尚需進一步優(yōu)化與改進。

綜上所述，本研究中原核表達的CyHV-2截短蛋白tORF25具有較好的免疫原性，同時利用截短蛋白制備出具有較好特異性的抗CyHV-2多克隆抗體，為抗CyHV-2新型疫苗的創(chuàng)制和免疫檢測試劑盒的研發(fā)奠定了前期基礎。