Dnmt1和GnRH在母羊初情期啟動(dòng)過程中下丘腦的分布定位

宮永勝 ， 丁 赫 ， 呂文發(fā) ， 王 軍

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林長(zhǎng)春130118)

初情期是動(dòng)物獲得繁殖能力的標(biāo)志，其啟動(dòng)時(shí)間關(guān)系到動(dòng)物的性成熟和繁殖性能，初情期啟動(dòng)過程極其復(fù)雜，其機(jī)制尚未完全闡明?，F(xiàn)已明確，下丘腦促性腺激素細(xì)胞以脈沖式分泌GnRH，其作用于垂體上促腺激素釋放激素受體(GnRH-R)，誘發(fā)促黃體生成素(Luteinizing hormone，LH)峰值引起母畜的初情期啟動(dòng)[1-2]。研究表明，初情期啟動(dòng)伴隨著轉(zhuǎn)錄抑制因子的DNA甲基化與組蛋白修飾的變化，從而激活相關(guān)基因參與初情期啟動(dòng)[3-4]。Dnmt1作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶維持著基因的甲基化，在DNA復(fù)制過程中，Dnmt1按照親本DNA的鏈來修復(fù)子鏈的特異甲基化模式[5]，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。

GnRH神經(jīng)元胞體主要存在下丘腦中的視前區(qū)和弓狀核[4]，DNA甲基化參與初情期啟動(dòng)，初情期啟動(dòng)過程中下丘腦 Dnmt1與GnRH的關(guān)系尚不清楚。本試驗(yàn)通過免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)研究Dnmt1和GnRH在母羊下丘腦中POA和ARC核團(tuán)的分布及兩者的關(guān)系，研究結(jié)果不僅可明確母羊初情期啟動(dòng)過程中Dnmt1和GnRH的分布規(guī)律，而且也為DNA甲基化調(diào)控母羊初情機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品 采集初情期啟動(dòng)不同階段(初情期前，臨近初情期，初情期)母羊的下丘腦組織，下丘腦前端止于視交叉，后端止于乳頭體，置于4%多聚甲醛中固定48 h，轉(zhuǎn)入20%蔗糖PBS進(jìn)行脫水，待其組織完全沉浸于溶液中，用OCT包埋劑對(duì)組織進(jìn)行包埋，制作下丘腦組織冰凍切片，切片厚度25 μm，用于免疫熒光雙標(biāo)記試驗(yàn)。

1.2 藥品和試劑 OCT包埋劑、冰凍切片快速抗原修復(fù)液、免疫染色封閉液和含抗熒光淬滅封片液等試劑，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；GnRH(ab5617)和Dnmt1抗體(OAEB01589)抗體，購(gòu)自AVIVA 生物有限公司；及相應(yīng)免疫熒光二抗，均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫熒光試驗(yàn) 利用冰凍切片快速抗原修復(fù)液對(duì)組織切片進(jìn)行修復(fù)，TBST洗片5 min，用4%多聚甲醛進(jìn)行固定、洗片，組織上滴加免疫染色封閉液，濕盒中37 ℃封閉1 h，以減少非特異性染色；棄去封閉液滴加GnRH一抗(稀釋比例為1∶500)，濕盒中4 ℃孵育過夜，擦干后滴加對(duì)應(yīng)的GnRH熒光二抗(稀釋比例為1∶200)，37 ℃孵育1 h；洗凈后滴加Dnmt1一抗(稀釋比例為1∶300)，4 ℃孵育過夜后，滴加對(duì)應(yīng)的Dnmt1熒光二抗(稀釋比例為1∶60)，同時(shí)對(duì)組織進(jìn)行復(fù)核染，滴加DAPI(工作液濃度1 μg/mL)室溫孵育5 min，用含抗熒光淬滅劑的封片液進(jìn)行封片，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.4 數(shù)據(jù)處理 通過Olympus激光共聚焦顯微鏡配套ZEN軟件分析免疫熒光圖片并統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)量。應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan′s法進(jìn)行多重比較確定各組之間的差異顯著性，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 Dnmt1和GnRH在下丘腦中POA的表達(dá)和分布 如圖1所示，在母羊下丘腦中POA均有Dnmt1和GnRH表達(dá)，且呈現(xiàn)共表達(dá)模式。陽性細(xì)胞數(shù)變化如圖2，初情期前期和臨近初情期下丘腦陽性細(xì)胞數(shù)差異不顯著(P>0.05)，初情期陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于初情期前期和臨近初情期(P<0.05)。

2.2 Dnmt1和GnRH在下丘腦中ARC的表達(dá)和分布 如中插彩版圖3所示，在下丘腦ARC核團(tuán)中均有Dnmt1和GnRH表達(dá)，且兩者呈現(xiàn)共表達(dá)模式。陽性細(xì)胞數(shù)變化如圖4，初情期前期和臨近初情期陽性細(xì)胞數(shù)差異不顯著(P>0.05),初情期陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于初情期前期和臨近初情期(P<0.05)

圖2 Dnmt1與GnRH共表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)

*：差異顯著(P<0.05)

圖4 母羊初情期啟動(dòng)過程中弓狀核Dnmt1與GnRH共表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)

*：差異顯著(P<0.05)

3 討論

初情期啟動(dòng)受下丘腦中樞調(diào)控，下丘腦分泌GnRH作用于垂體前葉，使其分泌促性腺激素刺激卵泡發(fā)育，性腺類固醇激素也可反饋到下丘腦控制GnRH分泌[6]?，F(xiàn)已明確，下丘腦中視前區(qū)和弓狀核是GnRH分布的主要核團(tuán)，也是GnRH接受雌激素反饋的重要位點(diǎn)[7]。現(xiàn)有研究表明，DNA甲基化作用可調(diào)節(jié)下丘腦初情期啟動(dòng)關(guān)鍵基因的表達(dá)[6]。Dnmt1作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶負(fù)責(zé)新合成的DNA單鏈和半甲基化DNA鏈維持在5-mc模式[5]，其在初情期啟動(dòng)過程中的作用尚不清楚。本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)Dnmt1在下丘腦POA和ARC均有表達(dá)，主要分布于母羊下丘腦ARC，其與GnRH存在明顯的共表達(dá)，且初情期啟動(dòng)時(shí)其共表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，GnRH在初情期啟動(dòng)過程中主要分布在下丘腦POA和ARC部位，這與以往研究結(jié)果一致。劉宵等發(fā)現(xiàn)，母羊出生后下丘腦各核團(tuán)GnRH細(xì)胞數(shù)量隨月齡增長(zhǎng)而增多[8]。Marta Wan′kowska等發(fā)現(xiàn)，在母羊初情期時(shí)POA中GnRH胞體數(shù)量減少[7]。目前有關(guān)Dnmt1在初情期啟動(dòng)過程中的表達(dá)分布還鮮有報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著初情期啟動(dòng)，Dnmt1在母羊下丘腦的POA和ARC均有表達(dá)。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Dnmt1和GnRH在ARC和POA呈現(xiàn)共表達(dá)模式，且共表達(dá)水平在初情期啟動(dòng)時(shí)最高，這提示Dnmt1可能通過調(diào)節(jié)GnRH表達(dá)量而參與母羊初情期啟動(dòng)?，F(xiàn)有研究表明，Roth CL等發(fā)現(xiàn)恒河猴初情期啟動(dòng)時(shí)伴隨著Dnmt1表達(dá)量的下降[9]。Kurian J R等研究表明，恒河猴初情期GnRH啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平降低[10-11]。

本研究?jī)H通過免疫熒光標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)Dnmt1和GnRH在下丘腦ARC和POA存在共表達(dá)模式，尚不能明確其作用的分子機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究探索。