紫外線誘導(dǎo)的 p53表達(dá)狀態(tài)不同的人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中差異表達(dá)磷酸化蛋白的DNA損傷修復(fù)通路分析△

王海娟，李春曉，王婷，張競堯，南鵬，王勁松，張雪燕，林晨，錢海利

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京1000210

蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要內(nèi) 容，在酶和其他重要功能分子活性的發(fā)揮、第二信使傳遞和酶的級聯(lián)反應(yīng)中起重要作用。細(xì)胞內(nèi)的許多蛋白通過磷酸化來行使DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯等功能。蛋白質(zhì)磷酸化網(wǎng)絡(luò)精細(xì)調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)對的各種應(yīng)激過程，例如，當(dāng)細(xì)胞暴露于紫外線損傷后，細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)蛋白被磷酸化激活，修復(fù)DNA；細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白被激活，細(xì)胞周期發(fā)生阻滯；如果DNA受損嚴(yán)重，有修復(fù)缺陷，細(xì)胞常通過p53依賴性凋亡發(fā)生凋亡[1-2]。p53是細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過程中最經(jīng)典的分子，多種基因毒性或非基因毒性應(yīng)激信號可以使p53的N端或C端的不同位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，修飾后的p53形成有生物學(xué)活性的四聚體，與靶基因上的p53反應(yīng)元件結(jié)合，控制下游靶基因的表達(dá)，從而引起細(xì)胞生長阻滯、凋亡，或細(xì)胞適應(yīng)DNA損傷而存活[3-4]。不同p53表達(dá)狀態(tài)的細(xì)胞在受到紫外線照射后所發(fā)生磷酸化的蛋白不同，其發(fā)生的DNA損傷修復(fù)途徑是否有差異還不甚清楚。為探討p53野生型及p53缺失型的人結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)紫外線照射后磷酸化蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異，本研究將紫外線照射后的人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)譜檢測，將兩組樣品中重疊的差異表達(dá)磷酸化蛋白及特異的差異表達(dá)磷酸化蛋白分別進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析，繼而用STRⅠNG數(shù)據(jù)庫軟件分析DNA損傷修復(fù)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，最后采用Reactome軟件分別繪制HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-中DNA損傷修復(fù)通路，以期為闡明p53調(diào)控DNA損傷修復(fù)的機(jī)制提供線索。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)室保存的人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-采用含10%胎牛血清（購自Uruguay的Thermo Fisher Scientific公司）、100 U/ml青霉素和100 ug/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（購自北京細(xì)工生物科技有限公司）培養(yǎng)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。

1.2 細(xì)胞處理過程

將對數(shù)生長期的細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中，貼壁過夜后棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次，每次30 s，盡量吸干培養(yǎng)皿中殘留的PBS，將培養(yǎng)皿置于紫外線燈下64 cm處照射30 s，相當(dāng)于4.4 MJ/cm2強(qiáng)度。細(xì)胞重新加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，4 h后提取總蛋白，同時提取未經(jīng)紫外線照射的細(xì)胞總蛋白作為對照。采用磷酸化蛋白純化試劑盒PhosphoProtein Purification Ki（t購自美國QiagenⅠnc公司）分離、濃縮、純化磷酸化蛋白。

1.3 蛋白質(zhì)譜檢測樣品信息

樣本：a.HCT116 p53-/-0 min；b.HCT116 p53-/-4 h；c.HCT116 p53+/+0 min；d.HCT116 p53+/+4 h。將每個樣品不少于200 ug磷酸化蛋白送至上海中科新生命科技有限公司進(jìn)行結(jié)腸癌細(xì)胞磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

首先對質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)的蛋白ⅠD進(jìn)行轉(zhuǎn)換，并將樣本間的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，然后分別比較樣品a、b之間及樣品c、d之間的差異表達(dá)蛋白，并對兩組結(jié)果進(jìn)行一致性分析。將兩組共同的差異表達(dá)磷酸化蛋白與不同的差異表達(dá)磷酸化蛋白分別進(jìn)行GO富集分析，然后用STRⅠNG數(shù)據(jù)庫軟件分析DNA損傷修復(fù)相關(guān)的差異表達(dá)磷酸化蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，最后采用Reactome軟件分別繪制HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)通路。

2 結(jié)果

2.1 紫外線照射前后HCT116 p53+/+和HCT116 p 53-/-細(xì)胞中差異表達(dá)的磷酸化蛋白

在所檢測到的301個磷酸化蛋白中，HCT116p53-/-在紫外線照射前后差異表達(dá)的磷酸化蛋白有210個，HCT116 p53+/+在紫外線照射前后差異表達(dá)的磷酸化蛋白有148個，僅在HCT116 p53+/+中發(fā)生差異表達(dá)的磷酸化蛋白有91個，僅在HCT116 p53-/-中發(fā)生差異表達(dá)的磷酸化蛋白有153個。HCT116 p53-/-與HCT116 p53+/+差異表達(dá)的磷酸化蛋白中有57個重疊，其中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)趨勢一致的磷酸化蛋白有39個，這些共同的差異磷酸化蛋白分別是AKAP12、ATF2、HCFC1、HN1、TJP3、KⅠ-AA1429、NUP153、PGRMC1、SEC22B、STMN1、C11orf84、CD44、EPHA2、FOXK2、HSF1、HSPB1、MED12、MKⅠ67ⅠP、RBM25、RRP1B、SMARCD2、TPR、TMPO、C17orf85、DKC1、CDC2L2、MTA1、MYH9、 SRRM2、 MDC1、 MED13L、 SRRM1、NOP56、NCOR2、NUP210、RPS3、SGPP1、NUMA1和RBM39。

2.2 紫外線照射后 p53表達(dá)狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞中的磷酸化蛋白的功能富集

為闡明紫外線照射后依賴p53及不依賴p53的磷酸化蛋白的功能，本研究首先對HCT116 p53-/-與HCT116 p53+/+兩組差異表達(dá)的磷酸化蛋白中交叉的表達(dá)趨勢一致的39個蛋白進(jìn)行了GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)無論p53野生型還是p53缺失型HCT116細(xì)胞，在紫外線照射后，表達(dá)明顯改變的磷酸化蛋白功能均富集在非編碼RNA加工、大分子加工、mRNA加工、細(xì)胞周期調(diào)控等方面（圖1）。

在p53表達(dá)缺失的HCT116細(xì)胞中，紫外線照射后特異的差異表達(dá)的磷酸化蛋白功能主要富集在mRNA加工、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞黏附、DNA解螺旋等方面；而在p53野生型的HCT116細(xì)胞中，紫外線照射后特異的差異表達(dá)的磷酸化蛋白功能主要富集在染色質(zhì)修復(fù)與組蛋白修飾、DNA損傷修復(fù)、蛋白質(zhì)泛素化修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面（圖2）。

圖1 紫外線照射后 p53表達(dá)狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞中共同的差異表達(dá)的磷酸化蛋白功能富集分析

2.3 紫外線照射后 p53表達(dá)狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的通路網(wǎng)絡(luò)

為進(jìn)一步分析紫外線照射后p53表達(dá)狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路的差異，本研究將兩種細(xì)胞中紫外線照射前后差異表達(dá)的DNA損傷修復(fù)相關(guān)的磷酸化蛋白錄入STRⅠNG數(shù)據(jù)庫中，對兩組中重復(fù)出現(xiàn)的磷酸化蛋白進(jìn)行去重處理，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖，最后采用Reactome軟件分別繪制HCT116 p53+/+和HCT116 p53-/-細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)通路。HCT116 p53+/+細(xì)胞在紫外線照射后特異磷酸化的DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白主要有DDB2、YY1和SMARCA5，主要參與全基因組核苷酸切除修復(fù)的DNA損傷識別（DNA damage recognition in GG-NER）。HCT116 p53-/-細(xì)胞在紫外線照射后特異磷酸化的DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白為NBN、TP53BP1、MDC1，主要參與非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）。兩種細(xì)胞中共同表達(dá)的差異磷酸化蛋白有CD44、RPS3、EPHA2、ATF2和TPR（圖3）。由此可見，在p53表達(dá)正常的情況下，紫外線導(dǎo)致的胸腺嘧啶二聚體會立即磷酸化DDB2、YY1等蛋白，識別DNA損傷位點(diǎn)，細(xì)胞進(jìn)行全基因組核苷酸切除修復(fù)。而在p53表達(dá)缺失的情況下，紫外線照射有可能導(dǎo)致更嚴(yán)重的DNA損傷，細(xì)胞中NBN、TP53BP1、MDC1蛋白磷酸化，參與的DNA損傷修復(fù)通路主要為NHEJ。這個過程有可能造成基因組的片段缺失，導(dǎo)致細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定（圖4）。

圖2 紫外線照射后 p53表達(dá)狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞中特異的差異表達(dá)的磷酸化蛋白功能富集分析

圖3 DNA損傷修復(fù)相關(guān)磷酸化蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)

圖4 p53表達(dá)狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞中磷酸化蛋白參與的DNA損傷修復(fù)通路

3 討論

蛋白磷酸化/去磷酸化普遍存在于各種細(xì)胞活動過程中，調(diào)節(jié)蛋白的活性或生物學(xué)功能。磷酸化激酶包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和酪氨酸蛋白激酶兩大類，它不僅通過影響許多生化酶的活性而參與糖、脂肪和蛋白質(zhì)等物質(zhì)代謝，而且參與各種信號傳遞，影響轉(zhuǎn)錄因子活性及其核轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。本研究結(jié)果表明p53野生型的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116在紫外線照射前后有148個磷酸化蛋白的表達(dá)水平發(fā)生明顯改變，而p53表達(dá)缺失的細(xì)胞中有210個差異表達(dá)的磷酸化蛋白。這提示在野生型p53存在的情況下細(xì)胞受到紫外線照射后磷酸化狀態(tài)的改變更有秩序，顯著改變的磷酸化蛋白數(shù)目少，組蛋白和其他蛋白有組織地出現(xiàn)泛素化等修飾。

多種因素導(dǎo)致的DNA損傷在修復(fù)過程中也離不開蛋白質(zhì)的磷酸化，DNA修復(fù)是細(xì)胞保護(hù)基因組完整性的一個重要功能系統(tǒng)，機(jī)體DNA修復(fù)能力的降低與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在p53野生型的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中，紫外線照射后細(xì)胞產(chǎn)生快速的應(yīng)激調(diào)控，DDB2、YY1及SMARCA5磷酸化水平明顯改變。有研究表明，內(nèi)源性YY1的失活增強(qiáng)了p53的積累以及p53靶基因在DNA損傷中的表達(dá)，并且YY1的失活使細(xì)胞對DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更敏感。YY1可能是p53對基因毒性應(yīng)激反應(yīng)的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子[5]。DDB2最初被鑒定為核苷酸切除修復(fù)中的DNA損傷識別因子，其參與紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)[6]。在全基因組核苷酸切除修復(fù)（global genome nucleotide excision repair，GG-NER）過程中，DDB2對基因組轉(zhuǎn)錄失活區(qū)域以及非轉(zhuǎn)錄鏈的修復(fù)應(yīng)答發(fā)揮重要的功能。有研究表明，DDB2通過阻滯Wnt信號通路從而抑制結(jié)腸癌的發(fā)展[7]，而且其在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)可以作為預(yù)測患者放射敏感性的生物標(biāo)志物[8]。SMARCA5不僅是SMARC基因亞家族的一員，而且還是染色質(zhì)重塑的ATPase亞單位。在DNA發(fā)生損傷時，SMARCA5被募集到DNA損傷位點(diǎn)，促進(jìn)DNA損傷修復(fù)[9]。

在p53表達(dá)缺失的情況下，紫外線照射不僅導(dǎo)致嘧啶二聚體產(chǎn)生，細(xì)胞還可能發(fā)生更嚴(yán)重的DNA損傷。本研究表明，在p53表達(dá)缺失的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中，紫外線照射后TP53BP1、MDC1和NBN的磷酸化水平明顯改變，這些差異表達(dá)的磷酸化蛋白參與的DNA損傷修復(fù)通路主要為NHEJ。NHEJ是真核生物細(xì)胞在不依賴DNA同源性的情況下，為了避免DNA或染色體斷裂導(dǎo)致的DNA降解或?qū)?xì)胞存活的影響，將兩個DNA斷端強(qiáng)行連接在一起的DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制。TP53BP1被稱為DNA損傷反應(yīng)的介質(zhì)和DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand break，DSB）修復(fù)的調(diào)節(jié)劑[10]。MDC1蛋白是DNA損傷后檢查點(diǎn)激活和后續(xù)DNA修復(fù)的核心參與者。磷酸化MDC1在不依賴于DNA損傷應(yīng)答途徑的基因組穩(wěn)定的維持性中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]。組蛋白伴侶抗沉默 因 子1a（anti-silencing function 1a，ASF1a）與MDC1相互作用并被募集到DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)以促進(jìn)磷酸化的ATM與MDC1的相互作用以及MDC1的磷酸化，促進(jìn)NHEJ，使細(xì)胞對DNA雙鏈斷裂更耐受[12]。ATM蛋白激酶是哺乳動物細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂反應(yīng)的核心。細(xì)胞經(jīng)射線照射后，二聚體ATM在Ser 1981處經(jīng)歷自磷酸化并解離成活性單體。有研究表明nibrin通過與ATM相互作用促使ATM活化[13]。

p53在DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，但有一些DNA損傷修復(fù)蛋白的磷酸化不依賴于p53，本研究發(fā)現(xiàn)RPS3、EPHA2、TPR、ATF2和CD44的磷酸化水平在紫外線照射HCT116 p53-/-與HCT116 p53+/+兩組細(xì)胞后均發(fā)生明顯改變，提示這些蛋白的磷酸化廣泛參與DNA損傷修復(fù)，且不受p53影響。RPS3作為40S核糖體亞基的組分參與翻譯過程及DNA損傷的加工，起到損傷DNA核酸內(nèi)切酶的作用。有研究表明，RPS3的核積累導(dǎo)致DNA修復(fù)活性在一定程度上增加，從而維持神經(jīng)元的存活狀態(tài)。減弱AKT介導(dǎo)的RPS3磷酸化可加速凋亡細(xì)胞的死亡并嚴(yán)重?fù)p害RPS3的核轉(zhuǎn)位[14]。EPHA2在野生型和突變型p53的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblast，MEF）中均可激活細(xì)胞凋亡程序，并且可被caspase 8抑制劑阻斷[15]。在黑色素瘤細(xì)胞中敲降A(chǔ)TR可顯著降低活性轉(zhuǎn)錄因子-2（ATF2）的磷酸化水平，并提高存活基因Sox10的表達(dá)，導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞死亡所需的DNA損傷應(yīng)答閾值顯著提高[16]。CD44是一種糖蛋白，當(dāng)細(xì)胞DNA損傷時，CD44可以穩(wěn)定ERBB2并共激活p-p38表達(dá)，然后通過同源重組（homologous recombination，HR）途徑促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，最終有助于提高細(xì)胞對放射治療的抗性[17]。

綜上所述，p53在紫外線照射誘導(dǎo)的蛋白磷酸化中發(fā)揮重要作用，p53狀態(tài)不同的HCT116細(xì)胞經(jīng)紫外線照射后發(fā)生的DNA損傷修復(fù)途徑有可能不同。