梔子苷干預(yù)LPS誘導RAW264.7巨噬細胞炎性反應(yīng)遞質(zhì)的研究

紀雯婷 尹湘君 劉姝伶 張海霞 王雪茜 魏 瑋

(1 北京中醫(yī)藥大學,北京,100029; 2 中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院,北京,100102)

梔子是目前公認從古沿用至今的品種,在歷代本草中均有詳細論述。其首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,被列為中品,主治“五臟邪氣”“胃中熱氣”[1]?！侗静菥V目》中詳細論述了梔子的作用,后代醫(yī)家更是多有發(fā)揮,總的來說,梔子具有能清熱,降火、止血的功效[2-6]?，F(xiàn)代藥理學研究證明,梔子苷中含有有機酸類化合物、揮發(fā)油類,黃麗類、香豆素類及其他多種化合物及微量元素[7-9],可用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[10-11]、糖尿病[12-13]、心血管系統(tǒng)疾病、等[14-15]。此外,梔子具有強大的抗炎作用[16-17]。研究證明,梔子能抑制炎性反應(yīng)分子NO以及炎性反應(yīng)分子TNF-α等的作用[18]。

梔子苷,屬于環(huán)烯醚萜類化合物,是梔子中的主要成分[19]。梔子強大的抗炎作用是由梔子苷單獨發(fā)揮,還是梔子中的其他成分主導,其研究結(jié)果尚不明確。本實驗比較梔子苷水提液、梔子苷標準品、50%梔子苷敲除液、50%梔子苷回填液對LPS刺激巨噬細胞后分泌NO與細胞因子IL-6及TNF-α的調(diào)控,試探究梔子發(fā)揮抗炎功效的主要成分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 細胞為小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7)購買于協(xié)和細胞資源中心。

1.1.2 藥物 梔子購于北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司,梔子苷標準品(貴州迪大,a0057),梔子苷敲除液自備。

1.1.3 試劑與儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher scientific公司),離心機(Eppendorf公司),胎牛血清(GBICO公司,10099141),DMEM培養(yǎng)基(GBICO公司,11995065),PBS(南京凱基公司,KGB5001),青鏈霉素(Hyclone公司,SV30010),脂多糖LPS(Sigma公司,L2630-100MG),TFN-αELISA試劑盒(Proteintech公司,KE10002)和IL-6ELISA試劑盒(Proteintech公司,KE10007),E-Plate板(艾森生物有限公司,00300600890),一氧化氮檢測試劑盒(碧云天公司,S0021)

1.2 方法

1.2.1 干預(yù)藥物的制備 梔子水提液:梔子100 g,用超純水煎煮藥物1 h,濃縮藥物濃度至1 g/mL。高速離心2次,5 000 r/min,離心10 min/次,收集上清,用0.22 μm的微孔濾器過濾除菌并分裝,置-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?0%梔子苷敲除液:梔子苷免疫親和色譜巧除法進行[20],敲除約50%的梔子苷,敲除液放入-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?0%梔子苷回填液用梔子苷水提液會回填50%梔子苷標準品,放入-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 分組與模型制備 收集培養(yǎng)的巨噬細胞,調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL,種于24孔培養(yǎng)板中,每孔500 μL。設(shè)立空白對照組、LPS模型組、梔子苷水提液組、梔子苷標準品組、50%梔子苷敲除液組、50%梔子苷回填組。除空白對照組外,其余各組均加入LPS建立炎性反應(yīng)模型,使LPS濃度達1 μg/mL,空白組則加入等量培養(yǎng)基。

1.2.3 給藥方法 梔子苷水提液組,梔子苷標準品組以及50%梔子苷敲除液組分別加入相應(yīng)藥物,經(jīng)調(diào)整藥物濃度,使梔子苷含量相同而50%梔子苷回填液組加入梔子苷回填液,使回填液組梔子苷含量是上述3組中梔子苷的2倍?？瞻讓φ战M與模型組LPS模型組加入等量培養(yǎng)基,使各組終體積相同。把細胞培養(yǎng)板放置于37 ℃、含5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培育24 h后,收取各組細胞上清,放入-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 檢測指標與方法

1.2.4.1 梔子水提液、梔子苷標準品及50%梔子苷敲除液對巨噬細胞的毒性作用 按照RTCA儀器說明操作。本實驗采用無標記細胞功能分析技術(shù)(Real Time Cellular Analysis,RTCA),能高效率、客觀、完整的獲取細胞的毒性動力學曲線。收集培養(yǎng)的巨噬細胞,調(diào)整細胞濃度為1×105個/mL,吹打均勻,加入16孔板,100 μL/孔,10倍稀釋等比例稀釋梔子水提液、梔子苷標準品及50%梔子苷敲除,按順序加入16孔中,每個濃度藥物設(shè)3復(fù)孔,把細胞培養(yǎng)板放置于RTCA儀之中培育72 h后,結(jié)束實驗,記錄干預(yù)24 h實驗數(shù)據(jù)并分析。

1.2.4.2 Griess法檢測各組NO含量 按照說明書法檢測NO的含量。取各組細胞培養(yǎng)上清液50 μL加入96孔板中,每組設(shè)6個復(fù)孔,依次加入氨基苯磺酸、萘基乙二胺,室溫避光孵育10 min,酶標儀540 nm波長檢測,并計算出各組NO的含量(濃度)。

1.2.4.3 ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清IL-6與TNF-α含量 按照試劑盒說明書推薦方法測定。根據(jù)說明書要求配制標準品液、10×標本稀釋液及洗滌液。于96孔酶標板中每孔各加入標準品與待測樣品100 μL,將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃ 2 h,用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次,向濾紙上印干;每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各100 μL(空白除外),將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃ 1 h,同前洗板;每孔加酶標抗體工作液100 μL。將反應(yīng)板置37 ℃ 30 min,同前洗板;每孔加入底物工作液100 μL,置37 ℃暗處反應(yīng)10 min;每孔加入100 μL終止液混勻;5 min內(nèi)用酶標儀檢OD值,計算出各組相應(yīng)IL-6與TNF-α含量。

2 結(jié)果

2.1 梔子水提液、梔子苷標準品、50%梔子敲除液對巨噬細胞的毒性研究 實驗可知,梔子水提液與梔子苷表標準品對巨噬細胞毒性很小,細胞培養(yǎng)24 h后,10 mg/mL的梔子水提液與梔子苷標準品對巨噬細胞較空白對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而濃度為150 μg/mL的50%梔子苷敲除液干預(yù)巨噬細胞24 h后即可表現(xiàn)出細胞毒性(P<0.05)。值得注意的是,50%的梔子苷敲除液在干預(yù)巨噬細胞的過程中,隨著敲除液濃度的增大,巨噬細胞的細胞指數(shù)反而上升,具有一定的促細胞增殖作用,75 μ/mL的敲除液效果最為突出(P<10-4)。后續(xù)實驗各組干預(yù)藥物的濃度依據(jù)50%敲除液毒性濃度進行選擇。

2.2 各組巨噬細胞炎性反應(yīng)遞質(zhì)NO表達(Griess法)實驗可知,LPS刺激巨噬細胞后NO釋放增多(P<10-4),而梔子苷水提液、梔子苷標準品、梔子苷敲除液均能降低LPS刺激巨噬細胞后NO的釋放,其中梔子水提液、50%梔子苷敲除液以及50%梔子苷回填液的作用最強,且作用差異有統(tǒng)計學意義(P<10-2)。而梔子苷標準品的作用相對較小(P<0.05)。

表1 實驗各組細胞上清NO水平比較

注:與空白對照組比較*P<0.05,**P<10-2,***P<10-3,****P<10-4;與LPS模型組比較,△P<0.05,△△P<10-2

圖1 梔子水提液對巨噬細胞的毒性研究

圖2 梔子苷標準品對巨噬細胞的毒性研究

圖3 50%梔子苷敲除液對巨噬細胞的毒性研究

注:圖1、圖2、圖3中RTCA法檢測梔子水提液、梔子苷表標準品以及50%梔子苷敲除液對巨噬細胞的毒性研究,與空白對照組(0 mg/mL)比較,*P<0.05,**P<10-2,***P<10-3,****P<10-4,NS:差異無統(tǒng)計學意義

圖4 檢測各組NO的表達統(tǒng)計結(jié)果

注:與空白組比較*P<0.05,**P<10-2,***P<10-3,****P<10-4;與LPS組比較△P<0.05,△△P<10-2

圖5 檢測各組IL-6與TNF-α的表達統(tǒng)計結(jié)果

注:與空白組比較*P<0.05,**P<10-2,***P<10-3,****P<10-4;與LPS組比較△P<0.05,△△P<10-2

2.3 各組巨噬細胞IL-6與TNF-α炎性反應(yīng)因子表達(ELISA檢測)實驗可知LPS刺激巨噬細胞后,巨噬細胞分泌TNF-α與IL-6較空白對照組增加(P<10-4),梔子水提液干、梔子苷標準品、50%梔子苷敲除液以及含50%梔子苷的梔子水提液干預(yù)后,能降低上述細胞因子的分泌(P<0.05),但各組調(diào)控作用差異無統(tǒng)計學意義。

表2 實驗各組細胞上清中IL-6與TNF-α水平

注:與空白對照組比較*P<0.05,**P<10-2,***P<10-3,****P<10-4;與LPS模型組比較,△P<0.05,△△P<10-2

3 討論

經(jīng)LPS刺激的巨噬細胞是成熟的炎性反應(yīng)模型[21]。在炎性反應(yīng)過程中,巨噬細胞作為重要的效應(yīng)細胞,一方面通過抗原識別及呈遞,激活免疫反應(yīng);另一方面分泌大量的炎性反應(yīng)遞質(zhì),導致廣泛的炎性反應(yīng)級聯(lián)反應(yīng)[22]。NO作為主要的炎性反應(yīng)遞質(zhì),在炎性反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。實驗結(jié)果可知,梔子水提液、梔子苷標準品、50%梔子苷敲除液、以及50%梔子苷回填液均對NO的分泌有抑制作用。其中,梔子苷標準品的作用較其他溫和?？梢?梔子中并不是單一成分梔子苷對NO的分泌起到抑制作用,梔子苷中的其他成分對NO的抑制作用可能更大。

TNF-α與IL-6均是巨噬細胞在炎性反應(yīng)中分泌的非常重要的促炎因子和調(diào)節(jié)免疫因子[23]。LPS刺激巨噬細胞促進IL-12、IFN-γ、IL-6、IL-1β等細胞因子的分泌[24]。IL-6、TNF-α細胞因子的增多,無疑介導或加重機體炎性反應(yīng)。當梔子水提液、梔子苷標準品、50%梔子苷敲除液、以及50%梔子苷回填液均對TNF-α與IL-6的分泌有抑制作用,且作用差異無統(tǒng)計學意義。可見梔子苷在梔子抗炎這一功效中發(fā)揮了作用,這種抗炎作用可能與梔子苷的含量相關(guān)。一定范圍內(nèi)的梔子苷能較為穩(wěn)定的發(fā)揮抗炎功效。此外,梔子中的其他成分也不能排除其抗炎的效能,其很可能與梔子苷共同調(diào)節(jié)炎性反應(yīng),使炎性反應(yīng)的其他癥狀得到改善。

綜上所述,梔子具有強大的抗炎作用,這種功效不僅僅體現(xiàn)在其主要成分梔子苷上,梔子中的其他成分也發(fā)揮了抗炎的作用。且梔子中不同成分很可能從不同的方面調(diào)節(jié)炎性反應(yīng),成分之間可能具有相互協(xié)助或者抑制的作用,從而改善炎性反應(yīng)。本次實驗僅從炎性反應(yīng)下游的致炎成分展開,尚需要進一步研究梔子苷與梔子在其他藥效作用上的關(guān)聯(lián)性,全面了解梔子苷對梔子的藥效貢獻。