3種常用藥物對壞鰓指環(huán)蟲的殺滅效果

張效平， 商寶娣， 李小義， 楊 星， 李正友

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210095； 2.貴州省水產(chǎn)研究所，貴州貴陽 550025)

隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展，頻繁暴發(fā)的魚病成為制約其進(jìn)一步發(fā)展的重要因素。指環(huán)蟲病是鯉科魚類養(yǎng)殖中高發(fā)、常見的疾病[1-2]。指環(huán)蟲(DactylogyrusDiesing)屬于單殖吸蟲綱(Monogenoidea)[3]，生活史簡單，無中間宿主，因此可以在養(yǎng)殖環(huán)境中迅速增殖和傳播。指環(huán)蟲的大量寄生給宿主帶來非常大的危害，如造成魚體機(jī)械性損傷，引起寄生部位病變[4]；破壞宿主器官的完整性，為其他病原生物(細(xì)菌、病毒等)入侵提供了入口；吮吸魚血、體液，與宿主爭奪營養(yǎng)，造成宿主消瘦[5]；刺激宿主產(chǎn)生大量分泌物，破壞宿主正常的生理活動，影響魚類呼吸[6]等。每年都會因指環(huán)蟲病暴發(fā)給漁民帶來重大經(jīng)濟(jì)損失。在我國常見的指環(huán)蟲種類有寄生于鯉魚(Cyprinuscarpio)和鯽魚(Carassiusauratus)的壞鰓指環(huán)蟲(DactylogyrusvastatorNybelin)、寄生于鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)的鰱指環(huán)蟲(D.hypophthalmichthys)與小鞘指環(huán)蟲(D.vaginulatus)以及寄生于草魚(Ctenopharyngodonidellus)的鰓片指環(huán)蟲(D.lamellatus)[7-8]等。

在魚類單殖吸蟲的防治過程中，藥物防治仍是較主要的一種方式。在治療過程中主要通過藥物長期浸泡的方式來殺滅體外寄生的單殖吸蟲。目前常用的殺蟲藥物主要有敵百蟲[9]、吡喹酮[10]、甲苯咪唑[11]等化學(xué)物質(zhì)。但有些藥物的長期浸泡對宿主魚的毒害作用也較大，因此在觀賞魚等魚類的養(yǎng)殖過程中，有時會通過短期浸泡來達(dá)到殺蟲的目的。

高錳酸鉀、福爾馬林、氯化鈉是3種常用的藥物，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中也經(jīng)常通過短期浸泡的方式來治療魚類寄生單殖吸蟲[12-15]。但目前還沒有關(guān)于這3種物質(zhì)對壞鰓指環(huán)蟲殺滅效果的詳細(xì)報道。鯉是貴州地區(qū)養(yǎng)殖規(guī)模最大的經(jīng)濟(jì)魚類，近年來，指環(huán)蟲病的暴發(fā)也越來越頻繁和嚴(yán)重。因此，本試驗以寄生于鯉鰓部的壞鰓指環(huán)蟲為研究對象，詳細(xì)研究這3種物質(zhì)在離體條件下對壞鰓指環(huán)蟲成蟲的殺滅效果，以及在體條件下高錳酸鉀、福爾馬林的殺蟲率。由于指環(huán)蟲蟲卵對藥物的抵抗性更強(qiáng)[16-17]，因此同時研究高錳酸鉀、福爾馬林溶液對蟲卵發(fā)育和孵化的影響。最后，進(jìn)行短期浸泡毒性試驗，為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的合理用藥提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗魚、寄生蟲及藥物

試驗用鯉體長約為(12.7±0.4) cm，于2017年5月購自貴州省遵義市。將這些剛購買的、沒有感染指環(huán)蟲的鯉置于水泥池中，與貴州省水產(chǎn)研究所實(shí)驗室之前保存的、感染壞鰓指環(huán)蟲的鯉以4 ∶1的數(shù)量比例進(jìn)行混養(yǎng)。在養(yǎng)殖過程中，每2 d換1次水?；祓B(yǎng)15 d之后，從水泥池中隨機(jī)選取10尾鯉進(jìn)行檢查，記錄指環(huán)蟲的感染情況。當(dāng)鯉的感染率為100%，且每尾魚體上寄生的壞鰓指環(huán)蟲的數(shù)量在30～50條時，可進(jìn)行下一步的殺蟲試驗。高錳酸鉀、福爾馬林、氯化鈉等3種試劑的規(guī)格與成分見表1。

1.2 離體條件下3種藥物對壞鰓指環(huán)蟲成蟲的殺滅效果

用魚安定(MS-222)將感染壞鰓指環(huán)蟲的鯉麻醉后，剪下鰓片，放在載玻片上。用解剖針將活躍的壞鰓指環(huán)蟲成蟲從鯉鰓部輕輕地剝離下來，在剝離的過程中注意保持蟲體的完整性。隨機(jī)選取20條壞鰓指環(huán)蟲，置于24孔板中，1孔1蟲，在孔內(nèi)事先加入2 mL各種待測的藥物，在22 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。所有試驗組均重復(fù)2次，并在試驗過程中設(shè)置1個空白對照組(孔內(nèi)只加入2 mL曝氣自來水)。高錳酸鉀測試濃度為5、10、20 mg/L；福爾馬林測試濃度為25、50、100 mg/L；氯化鈉測試濃度為1%、2%、3%。試驗開始后，每隔2 h將24孔板取出，在解剖鏡下觀察1次，記錄蟲體的存活情況，包括蟲體在藥物作用下的反應(yīng)和蟲體的產(chǎn)卵情況。當(dāng)蟲體在一定的時間內(nèi)沒有活動或是蟲體表面已經(jīng)出現(xiàn)自解現(xiàn)象時說明蟲體已經(jīng)死亡[18]。與此同時，試驗過程中還記錄全部蟲體死亡的時間，并且假設(shè)，如果在某一種藥物的作用下，全部蟲體的死亡時間少于24 h，說明這種藥物有效。

表1 試驗藥物的規(guī)格

1.3 在體條件下高錳酸鉀、福爾馬林對壞鰓指環(huán)蟲成蟲的殺滅效果

在體試驗中，每10尾感染壞鰓指環(huán)蟲的鯉被隨機(jī)分配在盛有40 L曝氣自來水的水泥池中，水溫維持在20～22 ℃。將每種待試化學(xué)物質(zhì)事先溶解在曝氣自來水中，配制成試驗用濃度，高錳酸鉀濃度為5、10、20 mg/L，福爾馬林濃度為25、50、100 mg/L。每個試驗組設(shè)置3個平行組，在試驗過程中同時設(shè)置1個空白對照組，即曝氣自來水中無任何化學(xué)物質(zhì)加入。試驗過程中不喂食、不換水，并記錄在試驗過程中鯉的死亡情況。高錳酸鉀的作用時間為30 min，福爾馬林溶液的作用時間為12 h。試驗結(jié)束后將試驗組及對照組中所有存活的鯉殺死，取下鰓片，置于玻璃板上，放在解剖鏡下觀察，記錄每個鰓片上壞鰓指環(huán)蟲的數(shù)量，并計算每個試驗組及對照組中寄生指環(huán)蟲的平均數(shù)量。根據(jù)公式(1)計算每個試驗組對壞鰓指環(huán)蟲的平均殺蟲率：

AE=(B-T)/B×100%。

(1)

式中：AE表示每個試驗組的平均殺蟲率；B表示對照組中壞鰓指環(huán)蟲的平均寄生數(shù)量；T表示每個試驗組中壞鰓指環(huán)蟲的平均寄生數(shù)量。

1.4 高錳酸鉀、福爾馬林對壞鰓指環(huán)蟲蟲卵的殺滅效果

將壞鰓指環(huán)蟲成蟲從鯉鰓部輕輕剝離下來，置于盛有曝氣自來水的24孔板中，在20 ℃條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)3 h后，收集蟲體所產(chǎn)的蟲卵，隨機(jī)分為3組，每組包含2個平行組，每組至少包含50枚蟲卵。在盛有蟲卵的24孔板內(nèi)，加入事先配制好的2 mL各種待試藥物(對照組中只加入相同體積的曝氣自來水)，高錳酸鉀濃度為5、10、20 mg/L，福爾馬林濃度為25、50、100 mg/L。將24孔板放置在22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用2 mL曝氣自來水替換每個孔內(nèi)的試驗藥物，繼續(xù)在22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到所有的蟲卵死亡或孵化為止。在試驗過程中，每2 d更換1次孔內(nèi)的曝氣自來水。每天在顯微鏡下觀察1次，記錄蟲卵的發(fā)育過程及孵化率。

1.5 試驗室條件下3種藥物對鯉的短期浸泡毒性試驗

測試高錳酸鉀(5、10、20 mg/L)、福爾馬林(25、50、100 mg/L)、氯化鈉(1%、2%、3%)3種試劑對鯉的短期浸泡毒性試驗，浸泡時間為12 h。試驗開始后，首先將各種化學(xué)物質(zhì)溶解在盛有40 L曝氣自來水的水泥池中，分別達(dá)到試驗設(shè)計的各種物質(zhì)的濃度。然后將10尾鯉分別添加到每個水泥池中。在試驗期間，水溫維持在20～22 ℃之間。每個試驗組設(shè)置2個平行組，試驗同時還設(shè)置1個空白對照組，在對照組中，水泥池內(nèi)不添加任何化學(xué)物質(zhì)。試驗期間停止喂食。觀察鯉在藥物作用下的生存情況，并及時剔除死亡個體。

1.6 數(shù)據(jù)分析

通過Mann-Whitney U檢驗對每個試驗組內(nèi)各個平行組之間的差異進(jìn)行顯著性檢驗。通過卡方檢驗對不同藥物作用下成蟲的殺蟲率及蟲卵孵化率進(jìn)行顯著性檢驗(P=0.05)。所有數(shù)據(jù)分析都是在SPSS 13.0軟件上進(jìn)行的。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體條件下藥物對壞鰓指環(huán)蟲成蟲的殺滅效果

在對照組中，前24 h中無死亡發(fā)生，絕大多數(shù)蟲體表現(xiàn)正常。隨著離體時間的延長，蟲體變得不活躍，開始出現(xiàn)死亡。前48 h僅有少數(shù)蟲體死亡，絕大多數(shù)蟲體死亡集中在離體的后半段時間。在離體82 h時，所有蟲體均死亡(圖1)。但是，所有蟲體在死亡之前均產(chǎn)了大量蟲卵。

與對照組相比，在5 mg/L高錳酸鉀作用下，蟲體沒有出現(xiàn)明顯的癥狀；在藥物的作用下，每個蟲體仍能產(chǎn)出幾枚蟲卵。然而，在10、20 mg/L濃度高錳酸鉀作用下，蟲體縮為一團(tuán)，不活躍。在10、20 mg/L高錳酸鉀作用下蟲體分別在6 、4 h 時均已死亡(圖1)，只有少數(shù)蟲卵產(chǎn)出。

在25 mg/L福爾馬林作用下，蟲體沒有出現(xiàn)明顯的癥狀，蟲體運(yùn)動活躍，每個蟲體仍能產(chǎn)出幾枚蟲卵。然而，在50、100 mg/L等2個濃度的福爾馬林作用下，蟲體變得不活躍并很快死亡，基本沒有蟲卵產(chǎn)出。

在1%氯化鈉作用下，蟲體的活力稍微減弱，但產(chǎn)卵過程可能受到藥物刺激，每個蟲體都能產(chǎn)一定數(shù)量的蟲卵。當(dāng)氯化鈉濃度升至2%、3%時，蟲體加入后立即受到影響，蟲體基本不動，體色加深，蟲體很快死亡且沒有產(chǎn)卵。

2.2 在體條件下藥物對壞鰓指環(huán)蟲成蟲的殺滅效果

在試驗過程中，試驗組和對照組中鯉均沒有出現(xiàn)死亡，不同平行組中指環(huán)蟲的感染水平也沒有顯著差異。由圖2可知，隨著藥物濃度的升高，2種藥物的殺蟲率也逐漸提高。20 mg/L 高錳酸鉀的殺蟲率最高，為84.4%，顯著高于濃度為5 mg/L的高錳酸鉀。100 mg/L福爾馬林的殺蟲率最高，為91.2%，但3個濃度的殺蟲率之間無顯著差異。高錳酸鉀與福爾馬林溶液最高殺蟲率之間也無明顯差異。

2.3 高錳酸鉀和福爾馬林對壞鰓指環(huán)蟲蟲卵的殺滅效果

在對照組中，壞鰓指環(huán)蟲蟲卵的孵化率為62.1%，孵化發(fā)生在蟲卵產(chǎn)出后的第4天至第11天。

與對照組相比，在高錳酸鉀所測試濃度范圍內(nèi)，壞鰓指環(huán)蟲蟲卵的孵化率并沒有明顯降低(圖3)，蟲卵的胚胎發(fā)育過程也與對照組類似，孵化都是在第4天被觀察到。

當(dāng)福爾馬林濃度為25 mg/L時，蟲卵孵育10 d后已經(jīng)發(fā)育為纖毛幼蟲狀(圖4)，但接下來沒有觀察到蟲卵成功孵化，所有纖毛幼蟲都在卵殼內(nèi)死亡。當(dāng)福爾馬林濃度升至50、100 mg/L 時，蟲卵孵育10 d后所有蟲卵都沒有發(fā)育(圖5)。

2.4 實(shí)驗室條件下3種藥物對鯉的短期浸泡毒性試驗

鯉在5 mg/L高錳酸鉀溶液的作用下沒有出現(xiàn)死亡，當(dāng)高錳酸鉀濃度為10 mg/L時，部分魚在浸泡6 h后出現(xiàn)癥狀，活力降低，上浮至水面。當(dāng)高錳酸鉀濃度為20 mg/L時，在浸泡1 h后部分鯉上浮至水面，反應(yīng)遲緩或失衡后身體翻轉(zhuǎn)。魚體表和鰓部分泌黏液，黏附大量的紅棕色污物，在浸泡后期部分魚死亡。

在福爾馬林溶液的浸泡下，鯉沒有出現(xiàn)死亡。當(dāng)福爾馬林濃度為100 mg/L時，在浸泡后期部分鯉開始出現(xiàn)輕微的中毒癥狀，有的呈不安狀或上浮，有的游動緩慢，鰓部黏液分泌增多。

在氯化鈉溶液作用下，鯉剛放入不久即有部分呈不安狀，或躥跳或游動較快。當(dāng)氯化鈉濃度達(dá)到2%時，30 min后鯉中毒較明顯，活力下降，浮在水面，個別魚體失去平衡，呈頭上尾下式浮在水面。當(dāng)氯化鈉濃度為3%時，部分鯉在浸泡的后期死亡。

3 結(jié)論與討論

高錳酸鉀在魚類養(yǎng)殖業(yè)中常用于水體的消毒和凈化，對原蟲類、單殖吸蟲類和錨頭蚤等寄生蟲有顯著殺滅效果[12]，也可用于防腐、防毒和防治細(xì)菌病等[13]。林克冰等證明，高錳酸鉀對本尼登蟲有很好的殺滅效果[19]。王忠華等也報道了高錳酸鉀在治療大黃魚刺激隱核蟲方面的應(yīng)用[20-21]。本研究表明，當(dāng)高錳酸鉀濃度升至10、20 mg/L時，離體條件下壞鰓指環(huán)蟲蟲體很快死亡，基本沒有蟲卵產(chǎn)出；在體條件下的殺蟲率也分別為68.7%、84.4%。Chan等研究表明，在22 ℃條件下，用20 mg/L高錳酸鉀浸泡20 min可減少50.6%的偽指環(huán)蟲[15]。壞鰓指環(huán)蟲蟲卵在高錳酸鉀作用下的孵化率雖然降低，但與對照比差異并不明顯，這一研究結(jié)果與Umeda等的研究結(jié)果類似，Umeda等曾證明在高錳酸鉀作用下，偽指環(huán)蟲蟲卵的孵化率降低，但是與對照比差異并不顯著[22]。本研究結(jié)果表明，10 mg/L高錳酸鉀在離體和在體條件下均可以較有效地殺滅壞鰓指環(huán)蟲，因此可以用于指環(huán)蟲病的短期浸泡(30 min)治療。

福爾馬林是強(qiáng)烈的廣譜性殺菌劑，能與蛋白質(zhì)中的氨基酸結(jié)合從而使蛋白質(zhì)變性失活。在水產(chǎn)上可用于殺滅車輪蟲病、小瓜蟲病等原生動物引起的魚病，以及吸蟲病和甲殼類寄生蟲病[13-14]。之前有很多關(guān)于福爾馬林殺蟲效果的報道。馬燕武等的研究表明，20～60 mg/L福爾馬林溶液對飄游魚波豆蟲和纖毛蟲有一定的防治作用[23]。福爾馬林濃度為 30 mg/L 時可以顯著減少銀鱸體上寄生的單殖吸蟲[24]。在溫度為22 ℃條件下，100 mg/L的福爾馬林溶液可以大幅減少偽秉指環(huán)蟲的寄生[15]。結(jié)果表明，當(dāng)福爾馬林濃度為50、100 mg/L時，在離體和在體條件下均可以有效地殺滅壞鰓指環(huán)蟲。福爾馬林對多種單殖吸蟲均具有較好的殺滅效果，如在濃度為300 mg/L的條件下作用30 min時，Sparicotylechrysophrii的成蟲和幼蟲迅速被殺死[25]；200 mg/L福爾馬林浸泡1 h可以殺死寄生于Pagruspagrus(暫無統(tǒng)一的中文名)體上的所有Microcotylesp.(暫無統(tǒng)一的中文名)[11]；以 250 mg/L (暫無統(tǒng)一的中文名)浸泡1 h對于寄生在Seriolalalandi(暫無統(tǒng)一的中文名)鰓部的Benedeniaseriolae(暫無統(tǒng)一的中文名)和Zeuxaptaseriolae(暫無統(tǒng)一的中文名)具有中等程度的殺滅效果[17]；400 mg/L福爾馬林浸泡25 min可以有效地殺滅寄生在Acanthopagrusaustralis(暫無統(tǒng)一的中文名)體上的Polylabroidesmultispinosus(暫無統(tǒng)一的中文名)的成蟲和幼蟲[26]。在本研究中還發(fā)現(xiàn)，在本研究中的3種測試濃度范圍內(nèi)，壞鰓指環(huán)蟲蟲卵都沒有孵化，并且在50、100 mg/L 濃度福爾馬林作用下蟲卵都沒有發(fā)育。Sitjà-Bobadilla等曾證明，在300 mg/L福爾馬林作用30 min時，Sparicotylechrysophrii(暫無統(tǒng)一的中文名)蟲卵沒有孵化發(fā)生[25]；Fajer-vila等也證明，福爾馬林可以有效抑制Ancyrocephalines(暫無統(tǒng)一的中文名)蟲卵的孵化[27]。但福爾馬林對單殖吸蟲Diplectanumaequans(暫無統(tǒng)一的中文名)蟲卵孵化率的抑制效果并不顯著[28]。在本研究中，福爾馬林對壞鰓指環(huán)蟲成蟲和蟲卵均有顯著的殺滅效果，因此可有效用于單殖吸蟲的防治中。

氯化鈉主要靠其滲透作用改變寄生蟲的滲透壓，殺滅一些體外寄生的原生動物及微生物，可以防治多種皮膚及鰓部寄生的原生動物、細(xì)菌病、水霉病等[13，29]。伍惠生指出，治療觀賞魚小瓜蟲病時用5%氯化鈉浸泡1～2 d，可以清除、殺滅水泥池的小瓜蟲及其胞囊[1]。濃度為1.0%的氯化鈉溶液對飄游魚波豆蟲和纖毛蟲也有一定的防治作用[23]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氯化鈉溶液的濃度為2%且作用時間為4 h時，離體條件下所有壞鰓指環(huán)蟲成蟲才死亡，但是宿主鯉在相同作用條件下已經(jīng)出現(xiàn)明顯的中毒癥狀。Chan等的研究結(jié)果表明，在溫度為22 ℃條件下，4%氯化鈉浸泡5 min可以顯著減少偽秉指環(huán)蟲，但也造成宿主魚黏液的脫落[15]。本研究結(jié)果表明，由于作用時間較長，氯化鈉溶液對壞鰓指環(huán)蟲的有效濃度在作用時間范圍內(nèi)可能也會對宿主鯉造成比較大的傷害，因此不適合應(yīng)用于鯉鰓部指環(huán)蟲的防治。

綜上所述，高錳酸鉀可用于殺滅指環(huán)蟲成蟲，但對蟲卵的孵化率卻沒有顯著影響；福爾馬林可以有效地殺滅指環(huán)蟲成蟲和蟲卵；在安全濃度的作用時間范圍內(nèi)，氯化鈉溶液對指環(huán)蟲成蟲沒有顯著效果。以上試驗結(jié)果對壞鰓指環(huán)蟲的有效控制具有指導(dǎo)意義。同時，在實(shí)際殺蟲過程中，要根據(jù)水溫等外界條件適當(dāng)調(diào)整各種藥物的濃度，以免造成宿主的死亡。