鄭孝振 毛珊珊 任益鋒 韓簫笛 宋俊杰

舒芬太尼是緩解急慢性疼痛的常用麻醉藥物，但長時間應用后會誘導產(chǎn)生耐受，從而對患者的疼痛控制及生活質(zhì)量產(chǎn)生不良后果［1］。已有研究發(fā)現(xiàn)N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體在體內(nèi)神經(jīng)發(fā)育、突觸可塑性及痛覺信號傳導等生理、病理過程中發(fā)揮著重要作用［2］。NMDA 受體 2B（NMDA receptor 2B，NR2B）是NMDA受體的一個重要亞基，參與外周痛覺感受閾擴大、中樞過度興奮及痛覺過敏的形成，可促進患者疼痛的產(chǎn)生及中樞性痛覺敏化形成［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，脊神經(jīng)結扎疼痛模型小鼠經(jīng)鞘內(nèi)注射NR2B亞基的選擇性抑制劑后，小鼠疼痛反應有明顯減弱的趨勢，提示NR2B表達水平與痛覺過敏的產(chǎn)生和維持密切相關［4］。目前NR2B基因表達在舒芬太尼耐受中的作用報道較少。本課題擬體外合成并篩選出針對NR2B基因的有效siRNA，經(jīng)采用鞘內(nèi)注射將siRNA導入舒芬太尼耐受模型小鼠體內(nèi)，研究脊髓背角NR2B表達水平在舒芬太尼耐受形成中的作用，為改善慢性疼痛患者生活質(zhì)量提供理論依據(jù)和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 小鼠飼養(yǎng)及模型構建

選擇32只Wistar成年雄性小鼠，購自浙江省實驗動物中心，其動物合格證號為SCXK（浙）2014-0001，小鼠體重在290～310 g。飼養(yǎng)室溫度為（24±3）℃，空氣濕度為60%左右，維持自然晝夜節(jié)律，小鼠均可自由飲食。小鼠隨機分為2組，均為16只，A組作為舒芬太尼假耐受對照，采用逐日遞增法皮下注射生理鹽水，第1天注射1 mL，每天遞增0.1 mL注射劑量，共21天。B組采用每天遞增法經(jīng)皮下注射舒芬太尼，其注射劑量（mL）與對應的A組注射的生理鹽水體積相同。

1.2 舒芬太尼耐受小鼠模型的評估

1.2.1 機械縮足反射閾值的測定

在第5天、10天、15天、20天、25天、30天將小鼠置于有機玻璃箱內(nèi)，采用弗雷纖維絲（VonFrey纖維）對小鼠精修機械感應閥值測試，待小鼠適應3天后，用弗雷纖維絲刺激小鼠后肢足底，持續(xù)刺激3 s左右，刺激強度由小到大，每次間隔30 s，若小鼠發(fā)生5次以上的縮足反應，則把該強度設為小鼠機械縮足反射閾值。

1.2.2 熱縮足反射潛伏期的測定

在第5天、10天、15天、20天、25天、30天將小鼠放入輻射熱測痛儀的玻璃格子中，實驗前使小鼠適應環(huán)境15 min，調(diào)節(jié)光源與石英玻璃板之間的距離，觀測小鼠的縮足反應，重復測量3次小鼠的熱刺激縮足潛伏期，刺激相同部位的時間間隔在15 min，不同部位間隔5 min。熱刺激縮足潛伏期指啟動光源照射至小鼠發(fā)生縮足反射的時間。若光源照射小鼠30 s無反應，則停止照射，每只小鼠檢測3次。熱刺激強度在整個實驗過程中維持一致。

1.3 siRNA-NR2B對脊髓背角細胞NR2B基因的敲減效果

1.3.1 siRNA-NR2B設計、合成和體外篩選

根據(jù)小鼠NR2B基因序列和siRNA設計工具設計針對NR2B的siRNAs，由上海銳賽生物技術有限公司合成，設計3個siRNA序列并設計相應反義寡核苷酸，同時設計一條含4個堿基錯配的siRNAs作為陰性對照。采用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)脊髓背角細胞（購自上海信裕生物科技有限公司），置于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞接種至12孔板，待細胞密度達到50%時，對細胞用不同的siRNA處理，均為20 nmol/L，采用陽離子脂質(zhì)體法包封siRNAs，并轉染體外培養(yǎng)脊髓背角細胞，見表1。

表1 siRNA-NR2B堿基序列Table 1 The base sequence of siRNA-NR2B

1.3.2 逆轉錄聚合酶鏈式擴增反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測脊髓背角細胞NR2B基因的mRNA水平影響

收集對數(shù)期脊髓背角細胞，加入TRIZol試劑提取各組細胞總RNA，采用Nanodrop分光光度儀檢測RNA質(zhì)量，通過反轉錄合成cDNA。以GAPDH基因作為內(nèi)參。NR2B基因引物：上游5′-GCTGACTGCACTGCACTGCAC-3′，下游 5′-GCATTGCCTCCTTGATTTGG-3′；GAPDH引物：5′-CGTGCACGTGCACGTCACTC-3′，下游 5′-GCACTGCACTGCACTGCAC-3′。PCR 條件設 置：95℃2 min；95℃ 30 s，58℃ 25 s，72℃ 40 s，32 個循環(huán)；72℃延伸 5 min。采用 2-ΔΔCt法計算目的基因相對水平。

1.3.3 Western blot技術檢測siRNA對脊髓背角細胞NR2B蛋白的水平

收集對數(shù)期脊髓背角細胞后，加入預冷的蛋白提取液，置于0℃條件裂解30 min，后以10 000 r/min轉速離心10 min，經(jīng)二喹啉酸（bicinchoninic acid，BCA）法檢測蛋白水平。將蛋白樣品與上樣液混勻后煮沸5 min，冷卻后用加樣槍轉入加樣孔中，采用10%十二酰硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳，上樣量均為100 μg，電壓120 V，電泳時間60 min左右，待溴酚藍染料移至凝膠底部1/3處停止電泳。采用濕轉法將凝膠上分離的蛋白轉至PVDF膜上，經(jīng)含5%脫脂奶粉的封閉液孵育30 min后，加鼠抗人NR2B蛋白單抗（按1∶600比例稀釋），4℃孵育過夜，經(jīng)TBST清洗后加入兔抗鼠二抗（按1∶2 000比例稀釋），置于搖床孵育2 h，經(jīng)TBST清洗后加ECL化學發(fā)光試劑，經(jīng)顯影、拍照后采用膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.4 siRNA對模型小鼠行為及脊髓背角細胞NR2B表達影響

1.4.1 siRNA對模型小鼠行為

機械縮足反射閾值的測定參見1.2.1步驟；熱縮足反射潛伏期的測定參見1.2.2步驟。

1.4.2 siRNA對模型小鼠脊髓背角組織細胞NR2B表達影響

小鼠經(jīng)戊巴比妥鈉深麻醉后斷頭處死，快速取出脊髓背角組織經(jīng)預冷的PBS清洗后，經(jīng)胰酶處理5 min，加入TRIZol試劑提取各組細胞總RNA。采用RT-PCR檢測大鼠脊髓背角細胞NR2B基因的mRNA水平影響（參見1.3.2步驟）。同時采用Western blot技術檢測siRNA對小鼠脊髓背角組織細胞NR2B蛋白的水平（參見1.3.3步驟）。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料均表達為均數(shù) ± 標準差（x±s），P＜0.05表示數(shù)據(jù)差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 舒芬太尼耐受小鼠的機械刺激縮足反射閾值變化

表2 舒芬太尼耐受小鼠的機械縮足反射閾值檢測（g）Table 2 Detection of mechanical reflex threshold in mice with sufentanil tolerance（g）

與A組相比，B組機械縮足反射閾值及熱縮足反射閾值檢測均明顯下降（P＜0.05），見表2、表3。

表3 舒芬太尼耐受小鼠的熱縮足反射閾值檢測（s）Table 3 Detection of paw withdrawal thermal latency of mice with sufentanil tolerance（s）

2.2 siRNA-NR2B對脊髓背角細胞的NR2B基因表達的抑制效果

將siRNA-NR2B轉染脊髓背角細胞后，通過RT-PCR及Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，siRNA-1對脊髓背角細胞的NR2B的mRNA及蛋白抑制效果較好（P＜0.05），見圖1。

圖1 siRNA對脊髓背角細胞的NR2B表達的影響Figure 1 Effect of siRNA on NR2B expression in spinal dorsal horn cells

2.3 舒芬太尼耐受小鼠的NR2B基因表達情況

通過RT-PCR及Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，舒芬太尼耐受小鼠NR2B基因表達水平上升（P＜0.05）；將siRNA-1經(jīng)鞘內(nèi)注射舒芬太尼耐受小鼠后，siRNA-1可顯著降低舒芬太尼耐受小鼠脊髓背角組織中NR2B基因的mRNA及蛋白水平（P＜0.05），見圖2。

圖2 siRNA對小鼠脊髓背角細胞的NR2B表達的影響Figure 2 Effect of siRNA on NR2B expression in spinal dorsal horn cells of mice

2.4 siRNA-NR2B對舒芬太尼耐受小鼠的作用效果

舒芬太尼耐受小鼠轉染siRNA 5天后，舒芬太尼耐受小鼠的機械縮足反射閾值顯著高于B組（P＜0.05）；舒芬太尼耐受小鼠的熱縮足反射閾值顯著高于B組（P＜0.05），見表4、表5。

表5 siRNA轉染后舒芬太尼耐受小鼠的熱縮足反射閾值變化（s）Table 5 Changes of paw withdrawal thermal latency in sufentanil tolerant mice after siRNA transfection（s）

3 討論

臨床醫(yī)療中阿片類藥物對緩解患者疼痛有重要的作用，但患者在使用阿片類藥物容易發(fā)生藥物耐受，導致提高麻醉藥物的用量，進一步導致藥物耐受的加重［5］。有研究發(fā)現(xiàn)對小鼠長期使用舒芬太尼可促使小鼠發(fā)生痛覺過敏，當對小鼠給予適量的氯胺酮（一種NMDA受體拮抗劑）可防止痛覺過敏發(fā)生［6-7］。Xie 等［8］發(fā)現(xiàn) NMDA受體拮抗劑可抑制阿片類藥物耐受的發(fā)生。NR2B亞基時NMDA受體的重要組織部分，對痛覺感知和中樞敏化的形成有重要價值。因此，闡明NR2B亞基對舒芬太尼耐受形成的作用，有助于臨床治療治療舒芬太尼耐受，提高藥物的鎮(zhèn)痛效果。

本研究通過采用逐日遞增法皮下注射舒芬太尼的方法建立舒芬太尼耐受小鼠模型，通過機械壓痛法測定小鼠痛域下降，提示舒芬太尼耐受小鼠模型建立成功。NMDA受體激活后可促使細胞內(nèi)的Ca2+離子水平上升，促進NO的合成，導致小鼠的機械疼痛閾值下降［9-10］。本研究結果提示NR2B亞基與舒芬太尼耐受形成密切相關，可見中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊髓水平NR2B亞基在痛覺感知、信號傳遞和阿片類藥耐受過程中起著重要作用。NR2B亞基作為NMDA受體的重要組成部分，介導疼痛神經(jīng)信息的傳遞，同時該受體可調(diào)控細胞內(nèi)外鈣離子及鎂離子水平，鈣離子的細胞內(nèi)流可活化鈣調(diào)蛋白，刺激神經(jīng)遞質(zhì)的釋放產(chǎn)生影響，進一步促使NR2B亞基活性增強，通過自身信號放大機制進一步促進舒芬太尼耐受的形成，選擇性抑制NR2B亞基活性可能是治療麻醉藥物耐受的有效方式。

RNA干擾技術是一種可特異性抑制目的基因表達的生物技術，可特異性阻斷目的基因轉錄［11-12］。本研究在設計并合成針對NR2B的siRNA后通過篩選試驗發(fā)現(xiàn)siRNA-1可有效抑制NR2B亞基表達水平。在給予舒芬太尼耐受小鼠siRNA-1后發(fā)現(xiàn)小鼠的機械縮足反射閾值及熱縮足反射閾值均顯著上升，與已有研究一致［13］。同時通過RT-PCR、Western blot實驗發(fā)現(xiàn)NR2B亞基表達水平下降，提示NR2B亞基表達水平舒芬太尼耐受密切相關，這可能是由于NR2B亞基介導神經(jīng)病理性疼痛，該蛋白表達水平下降可導致痛覺神經(jīng)元信號的傳遞功能削弱，進而產(chǎn)生一定的鎮(zhèn)痛作用［14-15］。NR2B亞基活性基團的磷酸化修飾對神經(jīng)疼痛的調(diào)控有明顯作用，本研究僅檢測了NR2B亞基表達水平對舒芬太尼耐受形成的影響，需同時檢測NR2B亞基的磷酸化水平，以更加全面地分析NR2B亞基對神經(jīng)疼痛調(diào)控的作用。Martel等［16］通過鞘內(nèi)注射NR2B-iRNA抑制脊髓背角NR2B的mRNA表達，結果減輕了外周炎癥引起的疼痛反應，表明NR2B在脊髓水平傷害性信息傳遞以及痛覺過敏的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮作用。Nakamori等［17］通過動物實驗發(fā)現(xiàn)NR2B亞基在選擇性拮抗劑作用后可緩解疼痛，并可改善記憶障礙等不良癥狀。本研究通過iRNA干擾技術發(fā)現(xiàn)脊髓背角NR2B亞基水平下降后可緩解舒芬太尼耐受形成，提示NR2B亞基可能是治療舒芬太尼耐受的作用靶點。

綜上所述，NMDA受體NR2B亞基水平上升可促使舒芬太尼耐受的形成，通過siRNA技術降低NR2B基因表達后可有效緩解舒芬太尼耐受，為改善慢性疼痛患者生活質(zhì)量提供理論依據(jù)和實踐基礎。