我國(guó)PEDV毒株結(jié)構(gòu)蛋白遺傳變異情況分析

曾旭健，包銀莉

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都，610030； 2.四川海林格生物制藥有限公司，四川 成都，610030）

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病 毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus， PEDV）引起的一種豬急性、感染性腸道疾病，臨床上以患病仔豬嘔吐、水樣腹瀉、脫水、消瘦為典型癥狀。在我國(guó)，2010年前主要以散發(fā)為主。2010年后該病全面暴發(fā)，并呈現(xiàn)新的流行特征：患病仔豬出現(xiàn)更加嚴(yán)重的腹瀉、嘔吐和脫水癥狀，死亡率高達(dá)80%～100%。這些特征提示現(xiàn)行流行毒株與現(xiàn)有疫苗毒株可能存在較大的差異。文章從PEDV結(jié)構(gòu)、流行株結(jié)構(gòu)蛋白遺傳變異情況、我國(guó)疫苗株基因分群情況以及流行株對(duì)疫病防控作用等多個(gè)方面對(duì)我國(guó)PEDV毒株結(jié)構(gòu)蛋白遺傳變異情況進(jìn)行分析，以期為豬流行性腹瀉的合理防控提供理論依據(jù)。

1 PEDV的結(jié)構(gòu)

PEDV屬于α-冠狀病毒，呈現(xiàn)典型的冠狀病毒結(jié)構(gòu)。基因組全長(zhǎng)約為28kb，由至少7個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs)構(gòu)成，分別編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白）和3個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（ORF1a，ORF1b，ORF3）。

2 流行株結(jié)構(gòu)蛋白遺傳變異情況

PEDV作為一種基因組較大的RNA病毒，容易發(fā)生核酸變異，導(dǎo)致新的變異株甚至基因型的出現(xiàn)。在PEDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因中，S基因的變異最大。

2.1 S蛋白

S蛋白是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，由1383個(gè)氨基酸（aa）組成。根據(jù) PEDV 與其他冠狀病毒S蛋白的同源性，可將S蛋白分為S1（1-789 aa）和S2（790-1383 aa）兩個(gè)部分。其中，S1是PEDV基因組的高變區(qū)域，包含多個(gè)中和表位和受體結(jié)合域，與病毒抗原性和吸附入侵密切相關(guān)。S2區(qū)變異性小，在病毒與宿主細(xì)胞膜融合的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

研究指出，目前不同PEDV毒株基因組的差異主要集中在S基因，特別是S1區(qū)域。在不同的 PEDV 毒株中，氨基酸的突變、插入、缺失現(xiàn)象均較為常見(jiàn)。通過(guò)對(duì)我國(guó)2014-2017年間各地報(bào)道的PEDV流行株的文獻(xiàn)進(jìn)行梳理，發(fā)現(xiàn)近年來(lái)PEDV流行毒株S基因遺傳變異主要有以下特點(diǎn)：1）由表1可見(jiàn)，各地區(qū)分離的PEDV流行株在基因水平上與傳統(tǒng)的PEDV的CV777株同源性較低，均不高于95%，說(shuō)明近年來(lái)PEDV毒株確實(shí)在基因水平上發(fā)生了變異；2）變異情況往往涵蓋基因缺失、插入和基因突變多種情況；3）突變區(qū)域主要分布在S1區(qū)；4）部分變異發(fā)生在PEDV毒株抗原保護(hù)位點(diǎn)，從而導(dǎo)致PEDV流行株免疫原性的改變；大部分變異為隨機(jī)發(fā)生，無(wú)規(guī)律可循，變異后所導(dǎo)致的毒株變化不得而知或處于研究狀態(tài)中。

2.2 M 蛋白

M蛋白是PEDV的囊膜糖蛋白，由226個(gè)氨基酸組成。編碼M蛋白的基因核苷酸序列具有高度的保守性。然而也有部分文獻(xiàn)指出，M基因也出現(xiàn)了一定的進(jìn)化和變異的趨勢(shì)。這種趨勢(shì)主要表現(xiàn)為核苷酸序列上的基因突變。董波等對(duì)2015年1月-2017年6月期間采自閩西地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)12份樣品分析發(fā)現(xiàn)，閩西毒株M基因與CV777 同源性為98． 7% 。此外，董波等指出在M基因上雖有11個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生突變，但是反應(yīng)在氨基酸水平上，其僅表現(xiàn)出3個(gè)氨基酸的改變。這些數(shù)據(jù)表明，不同PEDV毒株的M基因不論是在基因水平還是在氨基酸水平，仍然處于相對(duì)保守階段。2018年，丁衛(wèi)星等對(duì)收集的2株P(guān)EDV臨床毒株（D1和D3）的M基因進(jìn)行克隆，分析后發(fā)現(xiàn)，與CV777相比，D1株存在12個(gè)核苷酸的插入，導(dǎo)致存在4個(gè)氨基酸的插入。這個(gè)發(fā)現(xiàn)與以往的基因突變形式是不一樣的。基因插入是否會(huì)成為M基因變異的新的形式還有待進(jìn)一步的研究?？傮w而言，現(xiàn)階段M基因雖有突變，但仍是一個(gè)相對(duì)保守的基因。

圖1 PEDV結(jié)構(gòu)示意圖（畢靜，2013）

圖2 PEDV基因組結(jié)構(gòu)示意圖（王恩雨，2018）

2.3 E蛋白

E 蛋白是位于病毒囊膜上的小包膜蛋白，由76個(gè)氨基酸組成。研究發(fā)現(xiàn)E基因在同群冠狀病毒中具有很高的同源性。

表1 近年來(lái)PEDV流行毒株S基因遺傳變異情況匯總

表2 我國(guó)PEDV疫苗株基因分群情況一覽表

2.4 N蛋白

N蛋白是核衣殼蛋白，由441個(gè)氨基酸構(gòu)成。Chen等對(duì)中國(guó)部分省的32個(gè)豬場(chǎng)當(dāng)前流行的 PEDV的N基因進(jìn)行測(cè)序分析，結(jié)果顯示毒株之間同源性大于95．0%，和中國(guó)參考株同源性為95．6%～99．7 %，與致弱參考毒株CV777，DR13和83P-5 的核苷酸同源性為95．9 %～100．0% 。此外，所有的分析結(jié)果顯示，目前PEDV毒株之間N基因的變異為核苷酸的突變，不涉及核苷酸插入和缺失。這些研究結(jié)果表明N蛋白還是非常保守的。

3 我國(guó)疫苗株基因分群情況

自首個(gè)豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗上市以來(lái)，目前，我國(guó)共有8個(gè)PEDV聯(lián)苗獲得了新獸藥證書(shū)，涉及PEDV疫苗毒株7個(gè)，分別為CV777株及其致弱毒株弱毒CV777株，AJ1102株及其致弱毒株AJ1102-R株，弱毒株ZJ08株，SCSZ-1株和LW/L株。

Wang Dong等于2016年對(duì)60株P(guān)EDV中國(guó)流行株和12株P(guān)EDV經(jīng)典株進(jìn)行了全基因組進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果顯示，這些菌株可以劃分為兩個(gè)基因群：GI和GII。其中它們又可進(jìn)一步劃分為GI-a、GI-b、GII-a和GII-b四個(gè)亞群。在這個(gè)分群體系中，經(jīng)典株集中在GI群，流行株主要集中在GII群中。對(duì)PEDV疫苗株基因群進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，CV777株及其致弱毒株弱毒CV777株作為經(jīng)典株，屬于GI-a亞群；ZJ08株屬于GI-b亞群；AJ1102株及其致弱毒株AJ1102-R株則屬于GII-b亞群。文中未對(duì)新近獲得新獸藥證書(shū)的疫苗株進(jìn)行序列分析，相關(guān)文獻(xiàn)顯示，SCSZ-1株和LW/L株與經(jīng)典株CV777同源性較低，與流行株同源性可達(dá)98%以上。

4 流行株對(duì)PEDV防控的作用

PEDV作為一個(gè)含有大基因組的RNA病毒，與DNA病毒相比，其病毒基因組更容易發(fā)生重組和變異。從遺傳進(jìn)化上而言，變異是病原微生物主動(dòng)適應(yīng)環(huán)境和宿主的一種表現(xiàn)。當(dāng)其生存環(huán)境發(fā)生改變時(shí)，其必然進(jìn)行自我改變以適應(yīng)新的生存環(huán)境。當(dāng)環(huán)境壓力增大，病原微生物不論是在變異的程度上，還是在變異的速度上都會(huì)有顯著地提升。這也就解釋了我國(guó)豬流行性腹瀉疫情以2010年為分水嶺、后期呈現(xiàn)暴發(fā)形勢(shì)的原因。

眾所周知，對(duì)于疫病防控而言，選用與導(dǎo)致該疫病發(fā)生的病原微生物進(jìn)行免疫接種往往會(huì)獲得非常好的免疫保護(hù)作用。但是在現(xiàn)實(shí)情況下，完全依賴流行株對(duì)疫病進(jìn)行防控是非常不可取也無(wú)法完全實(shí)現(xiàn)的。一方面，基因的變異是一種生物自發(fā)的行為，環(huán)境壓力不同導(dǎo)致的變異情況也就不同，從而出現(xiàn)同一時(shí)間段不同地區(qū)不同豬場(chǎng)的流行株存在差別。一味的套用變異株死/活疫苗，只會(huì)讓自己的豬場(chǎng)疫病情況更加復(fù)雜。另一方面，疫苗的研發(fā)是有滯后性的。目前雖然可以利用分子方法對(duì)流行株的基因組進(jìn)行分析，但是無(wú)法對(duì)變異進(jìn)行預(yù)測(cè)。而疫苗開(kāi)發(fā)是需要時(shí)間的。一個(gè)新的疫苗從研發(fā)、生產(chǎn)到最終的上市需要大量的時(shí)間，而在這段時(shí)間中毒株的變異仍然在發(fā)生。因此人們永遠(yuǎn)用不上由最新的流行株生產(chǎn)的疫苗。再次，毒株是疫苗不可或缺的一部分，但不是唯一的構(gòu)成。一種疫苗的好壞不僅與毒株有關(guān)，還與佐劑、生產(chǎn)工藝、疫苗質(zhì)量等因素息息相關(guān)。而對(duì)于疫苗的臨床使用效果而言，疫苗的使用方法、免疫程序、保存條件等因素更是至關(guān)重要的。

對(duì)于豬流行性腹瀉的防控而言，我們不僅要選擇適宜的疫苗，更要采用合適的免疫方式，結(jié)合最優(yōu)的免疫程序，做好環(huán)境和飼養(yǎng)的管理以及其他生物安全防護(hù)方面的措施。

（參考文獻(xiàn)略。如有需要，請(qǐng)與作者聯(lián)系。）