陳亦兒

摘 要：基因編輯技術(shù)是用于編輯改造生物DNA的技術(shù)。本文主要介紹的是目前最常用的CRISPR技術(shù)。該技術(shù)改造于細(xì)菌及古細(xì)菌防止外源DNA入侵的特異性免疫系統(tǒng)，其中Cas9型最為簡(jiǎn)便實(shí)用。隨著CRISPR技術(shù)的逐漸完善，其高效、簡(jiǎn)便、快捷的優(yōu)點(diǎn)使其在基礎(chǔ)研究，臨床醫(yī)學(xué)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中都得到了廣泛應(yīng)用。只要能正確合理的利用，CRISPR將極大地推動(dòng)生命科學(xué)的發(fā)展與進(jìn)步。

關(guān)鍵詞：CRISPR；基因編輯；醫(yī)學(xué)研究；農(nóng)業(yè)生產(chǎn)

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1671-2064（2018）20-0189-02

1 CRISPR基因編輯技術(shù)

基因編輯技術(shù)是用于編輯改造生物DNA的技術(shù)。目前ZFN（zinc-finger nucleases，鋅指核酸酶）技術(shù)、TALEN （transcription activator-like effector nucleases，轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶）技術(shù)和CRISPR（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat，成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)）技術(shù)并稱為三大基因編輯技術(shù)。其中，新興的CRISPR技術(shù)相較TALEN技術(shù)和ZFN技術(shù)更簡(jiǎn)易、更靈活、更高效，成本也更低，被認(rèn)為是目前最有發(fā)展前景的基因編輯技術(shù)。

1987年Nakata研究組發(fā)現(xiàn)在位于IAP基因的3端存在堿基高度同源序列重復(fù)出現(xiàn)，引起生物科學(xué)界的廣泛關(guān)注。不久后，Jansen實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)這種新型的DNA序列僅存在于細(xì)菌及古細(xì)菌中，并將這種序列稱為成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)，即CRISPR。他們將臨近CRISPR位點(diǎn)的基因命名為CAS（CRISPR-associated）基因。2012年，科學(xué)家們通過體外實(shí)驗(yàn)證明了成熟的crRNA（CRISPR-derived RNA）指導(dǎo)CAS9蛋白在目標(biāo)DNA上引起雙鏈斷裂。2013年，CRISPR/Cas系統(tǒng)逐步應(yīng)用在基因編輯中。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)原理

CRISPR/Cas系統(tǒng)主要由兩個(gè)部分組成：執(zhí)行識(shí)別功能的前導(dǎo)序列與CRISPR簇，和執(zhí)行切割整合功能的Cas蛋白。CRISPR-Cas系統(tǒng)對(duì)外來DNA序列進(jìn)行識(shí)別主要依靠CRISPR基因片段。CRISPR序列通常由21bp-48bp較短的、保守的重復(fù)序列（repeats）組成，其序列由兩個(gè)間隔序列（spacer）隔開。在不同物種中，因?yàn)榘l(fā)揮作用的方式不盡相同，CRISPR系統(tǒng)被分為三類：TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ。

目前最常用的基因敲除技術(shù)——CRISPR/Cas9屬于TypeⅡ。Cas9基因編碼的Cas9蛋白是一種非特異性CRISPR結(jié)合核酸內(nèi)切酶，該蛋白具有核酸酶的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，因此可以分別切割DNA的兩條單鏈。當(dāng)外源DNA侵入細(xì)胞時(shí)，前導(dǎo)序列會(huì)作為啟動(dòng)子引導(dǎo)CRISPR序列轉(zhuǎn)錄出兩種RNA：pre-crRNA（pre-CRISPR-derived RNA）和tracrRNA（trans-acting crRNA）。tracrRNA由重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄而成，具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)，而pre-crRNA則由整個(gè)CRISPR序列轉(zhuǎn)錄而成的大型RNA分子。tracrRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與pre-crRNA的重復(fù)序列部分結(jié)合，而后Cas9蛋白與tracrRNA結(jié)合形成Cas9/tracrRNA/crRNA復(fù)合物。該復(fù)合物將掃描整個(gè)外源DNA，識(shí)別與crRNA堿基互補(bǔ)的原間隔序列，而后crRNA就會(huì)與原間隔序列DNA的一條單鏈以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式雜交，形成R環(huán)。這時(shí)，Cas9蛋白的RuvC限制酶將剪切外源DNA分子未與crRNA結(jié)合的非互補(bǔ)鏈，而其HNH酶將剪切crRNA的互補(bǔ)鏈。這樣，外源DNA雙鏈斷裂，目的基因就會(huì)被敲除。如圖1所示。

3 CRISPR技術(shù)優(yōu)勢(shì)

CRISPR技術(shù)在近年來突飛猛進(jìn)，與較早的兩項(xiàng)基因編輯技術(shù)相比，CRISPR技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單、構(gòu)建速度快，成本更低。

相比于ZFN技術(shù)，CRISPR技術(shù)更加高效。ZFN在對(duì)豬的Ppar-γ基因的打靶活性只有4%，對(duì)GGTA1基因的打靶效率僅為1%，而對(duì)IL2RG 基因的更低，僅為0.5%。以此可以看出，ZFN技術(shù)的打靶效率相對(duì)較低。而利用CRISPR技術(shù)對(duì)豬的vWF基因進(jìn)行基因敲除，單等位基因的敲除效率高達(dá)68%，雙等位基因的敲除效率也達(dá)到37%。對(duì)豬的其他基因，例如BMP15基因，基因敲除效率也可達(dá)到20%以上。同時(shí)，CRISPR/Cas9與ZFN造成的基因突變作用效果相似。雖然TALEN技術(shù)和CRISPR/Cas技術(shù)在設(shè)計(jì)原理上都相對(duì)簡(jiǎn)單，但相比于TALEN技術(shù)，CRISPR技術(shù)更加簡(jiǎn)便、快捷，這主要體現(xiàn)在體系構(gòu)建過程中。在構(gòu)建過程中，TALEN體系大約需要20個(gè)重復(fù)序列通過分子克隆或TALE重復(fù)組裝方法定向連接，載體構(gòu)型龐大，操作繁瑣。而CRISPR體系的Cas9蛋白和gRNA骨架對(duì)于任何靶基因的操作都可以共享，針對(duì)特定基因只需要在現(xiàn)有體系基礎(chǔ)上變動(dòng)20或30個(gè)堿基的向?qū)蛄屑纯蓪?shí)現(xiàn)，且容易合成獲得。盡管TALEN技術(shù)的特異性略高于CRISPR技術(shù)，但通過在選擇CRISPR/Cas9切割位點(diǎn)時(shí)對(duì)全基因組序列進(jìn)行全面的分析，可降低脫靶效率。

4 CRISPR技術(shù)應(yīng)用

隨著CRISPR技術(shù)的逐漸完善，與CRISPR技術(shù)有關(guān)的實(shí)際應(yīng)用也在不斷發(fā)展。

醫(yī)學(xué)研究方面，以CRISPR/Cas9技術(shù)為基礎(chǔ)建立的基因編輯模式已經(jīng)非常成熟。例如利用Cas9基因敲入技術(shù)得到的患肺腺癌小鼠模型，該模型能夠體現(xiàn)多基因共同作用對(duì)肺癌表型的影響，更準(zhǔn)確地反應(yīng)癌癥發(fā)生的機(jī)制和疾病的表型，在生物學(xué)和疾病建模中得到廣泛應(yīng)用；通過培育酪氨酸酶基因敲除型豬和PARK2、PINK1雙基因敲除型豬建立的人類白化病和帕金森綜合癥兩種豬模型，為人類異種器官移植的研究起到了推動(dòng)作用。在病毒感染疾病治療中，利用CRISPR技術(shù)將HIV病毒的主要攻擊對(duì)象——人體免疫T細(xì)胞上的HIV-1病毒移除，能夠使HIV無法進(jìn)一步感染其他細(xì)胞，這使根治艾滋病成為可能。在治療遺傳性疾病的應(yīng)用中，利用CRISPR系統(tǒng)去除一個(gè)可引起眼睛中感光細(xì)胞缺失的基因突變，或可以治療視網(wǎng)膜色素變性，以恢復(fù)遺傳性視網(wǎng)膜色素變性患者的視力。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，CRISPR技術(shù)用于建立作物調(diào)控體系，增強(qiáng)農(nóng)作物的產(chǎn)量。利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)粳稻zhonghua11的Gn1a、DEP1、GS3、IPA1這4個(gè)與產(chǎn)量相關(guān)的基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯，4個(gè)基因的突變效率分別為42.5%、67.5%、57.5%和27.5%，總體突變效率較高。并且第二代中Gn1、DEP1和GS3基因發(fā)生突變的水稻植株分別提高了穗粒數(shù)、密穗數(shù)和千粒重，增加了該水稻品種的產(chǎn)量。此外，CRISPR技術(shù)在增強(qiáng)家畜抗病方面發(fā)揮了巨大的作用。CD163基因被認(rèn)為是豬藍(lán)耳病病毒的受體基因，CD1D是一類抗原呈遞因子。利用CRISPR/Cas9技術(shù)分別敲除豬的這兩個(gè)基因，獲得其基因編輯型豬。后續(xù)研究表明，該種基因編輯豬在接受藍(lán)耳病毒株后未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，能夠有效地抵抗藍(lán)耳病病毒感染，而7頭對(duì)照豬全部表現(xiàn)出典型的藍(lán)耳病臨床癥狀。藍(lán)耳病是養(yǎng)豬業(yè)在全球范圍內(nèi)危害性最高的傳染病之一，通過敲除CD163和CD1D基因獲得基因突變豬種，能夠有效地減少藍(lán)耳病造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失。

5 總結(jié)與展望

CRISPR/Cas9技術(shù)簡(jiǎn)便、易操作、效率高、成本低，自問世以來就有著廣大應(yīng)用前景。通過CRISPR技術(shù)，能夠更簡(jiǎn)易地編輯基因，從而獲得具有目的性狀的生物。在醫(yī)學(xué)方面，CRISPR技術(shù)或能有效地治療遺傳病，如將患病胚胎的部分胚胎干細(xì)胞取出進(jìn)行基因編輯，移除感病基因，再將基因編輯細(xì)胞注射回胎兒的囊胚腔中進(jìn)行治療。將CRISPR技術(shù)應(yīng)用于編輯經(jīng)濟(jì)生物的基因，使生物產(chǎn)品增產(chǎn)，能夠增加社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。因此，充分發(fā)揮CRISPR技術(shù)的積極作用，將給人類的生產(chǎn)生活帶來福音。

而美中不足的是，CRISPR系統(tǒng)存在一定的脫靶概率，操作過程中可能發(fā)生編輯錯(cuò)誤。若在基因治療時(shí)發(fā)生難以立即察覺的編輯錯(cuò)誤，將有可能對(duì)患者的健康甚至生命造成威脅。為降低靶效應(yīng)帶來的不良影響，目前采用誘導(dǎo)Cas9蛋白的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域失活，形成切割單鏈的Cas9蛋白的方法。另一方面，由于CRISPR技術(shù)編輯功能過于強(qiáng)大，若不加節(jié)制的開發(fā)使用，或?qū)⒁l(fā)倫理，社會(huì)安全等嚴(yán)重問題。對(duì)此應(yīng)建全相關(guān)法律體系，限制CRISPR技術(shù)的濫用，引導(dǎo)該技術(shù)向正確的方向發(fā)展。

CRISPR技術(shù)有著其它基因編輯技術(shù)難以替代的優(yōu)點(diǎn)。若正確地利用CRISPR技術(shù)，不斷對(duì)其進(jìn)行改造使之更加簡(jiǎn)易可控，將會(huì)極其有效地推動(dòng)生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展和進(jìn)步。

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