基于變性梯度凝膠電泳和MiSeq高通量測序技術(shù)分析恩施地區(qū)臘肉的細(xì)菌多樣性

董 蘊，王玉榮，王 堯，廖 華，趙慧君，郭 壯,3,*

（1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.恩施市農(nóng)業(yè)局，湖北 恩施 445000；3.恩施市公共檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000）

臘肉主要是以鮮豬肉或冷凍豬肉為原料，添加食鹽等腌制后經(jīng)烘烤、晾曬或熏制而成的傳統(tǒng)非即食性發(fā)酵肉制品，我國湖北、湖南、四川、云南、廣東和黑龍江等多地區(qū)一直以來均有制作和食用臘肉的習(xí)慣[1-2]。在臘肉的整個發(fā)酵與貯藏過程中，微生物與臘肉中的蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的反應(yīng)不僅賦予臘肉色澤鮮明、風(fēng)味獨特的品質(zhì)，同時也有可能使成品受到雜菌污染[3-4]。因此，采用合適的技術(shù)對臘肉制品中的微生物種類及多樣性進(jìn)行解析是極為必要的。

劉曉蓉等[5]采用純培養(yǎng)手段從自然發(fā)酵臘肉中分離出28 株菌株，經(jīng)鑒定其中有4 株隸屬于乳酸桿菌屬；劉書亮等[6]采用分離純化和生理生化鑒定相結(jié)合的方法從12 份傳統(tǒng)腌臘肉制品中分離出戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、食品乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）和清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）等菌株；陳競適等[7]以湘西臘肉為研究對象，采用稀釋平板計數(shù)法對其微生物結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)酵母菌、霉菌和微球菌是其主要微生物群落；馮秀娟等[8]以湖南傳統(tǒng)臘肉為原料，采用傳統(tǒng)微生物學(xué)方法對發(fā)酵過程中微生物的生長情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)乳酸菌和葡萄球菌為其中的優(yōu)勢菌；王海燕等[9]采用傾注平板和平板劃線法從傳統(tǒng)湖南臘肉中分離出289 株葡萄球菌；李福榮等[10]采用純培養(yǎng)手段對信陽傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉中的細(xì)菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢細(xì)菌為葡萄球菌和微球菌。以上研究均采用以純培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)微生物學(xué)手段對臘肉中的微生物進(jìn)行分析，發(fā)掘了大量的微生物菌種資源，但該方法具有一定的局限性，不能鑒定出不可培養(yǎng)的微生物，不能全面、準(zhǔn)確地反映樣品的微生物信息[11]。變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)能夠應(yīng)用于食品中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究，具有操作簡單易行、靈敏度高、可檢測到1 個核苷酸水平的差異等特點[12]，目前在豬肉[13]、鴨肉[14-15]和雞肉[16]冷藏過程中的微生物多樣性變化及發(fā)酵肉制品[17]和屠宰場廢水[18]的微生物多樣性解析中有著廣泛的應(yīng)用。較之DGGE技術(shù)，MiSeq高通量測序技術(shù)具有通量高、能夠?qū)崿F(xiàn)樣品間平行分析的優(yōu)點[19]，目前在肉制品發(fā)酵用菌株基因組測序[20-21]、雞肉制品[22]和火腿腸[23]腐敗微生物鑒定及食用肉制品對腸道菌群多樣性的影響方面[24]有著廣泛的應(yīng)用。DGGE和MiSeq高通量測序技術(shù)相結(jié)合，亦應(yīng)用于牛肉等肉制品的細(xì)菌多樣性研究中[25]。目前，關(guān)于恩施地區(qū)臘肉細(xì)菌多樣性評價的研究還較少，將DGGE和MiSeq高通量測序技術(shù)相結(jié)合，用于臘肉制品微生物多樣性解析的研究也較少。

本研究采用免培養(yǎng)、結(jié)果直觀可靠的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-DGGE技術(shù)與MiSeq高通量測序技術(shù)相結(jié)合的方法對采集自恩施地區(qū)農(nóng)家自制臘肉的細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析，以期為該地區(qū)臘肉品質(zhì)的保障及微生物菌種資源發(fā)掘提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

臘肉：湖北省恩施土家苗族自治州農(nóng)家自制，5 份樣品分別編號為LR1、LR2、LR3、LR4和LR5。

聚丙烯酰胺、尿素、N,N-亞甲基二丙烯酰胺、過硫酸銨、冰醋酸、甲醛和硝酸銀（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；QIAGEN DNeasy mericon Food Kit提取試劑盒 德國Qiagen公司；5×FastPfu Buffer、10×PCR Buffer、dNTPs Mix、DNA聚合酶（5 U/μL）、pMD18-T載體 寶生物工程（大連）有限公司；6×Loading buffer、DL2000、DL15000 DNA Marker 寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；2×PCR mix 南京諾唯贊生物科技有限公司；DGGE擴(kuò)增引物ALL-GC-V3F（5’-CGCC CGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACC GGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）/ALL-V3R（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’）和高通量測序引物338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）/806R（5’-GGACTACHVGGGT-3’） 武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；Axygen清潔試劑盒 北京科博匯智生物科技發(fā)展有限公司；大腸桿菌（E. coli）Top10 本實驗室保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

HBM-400B拍擊式無菌均質(zhì)器 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；ND-2000C微量紫外分光光度計美國Nano Drop公司；DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠；VeritiTM96孔梯度PCR擴(kuò)增儀 美國AB公司；PowerPacTMBasic穩(wěn)壓儀、DCodeTMSystem、UVPCDS 8000凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；MiSeq PE300高通量測序平臺 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理及宏基因組DNA提取

參照GB/T 4789.17—2003《食品衛(wèi)生微生物檢驗 肉與肉制品檢驗》進(jìn)行取樣，加入滅菌水225 mL混勻后300 r/min條件下離心10 min，取上清液；然后將上清液在10 000 r/min條件下離心10 min，保留沉淀[26]。按照QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒使用說明中的方法提取樣品總DNA，并用微量紫外分光光度計檢測其濃度和純度。

1.3.2 細(xì)菌PCR-DGGE指紋圖譜分析

以提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系及反應(yīng)參數(shù)參照文獻(xiàn)[27]中的方法并略作改動：10×PCR Buffer 5 μL、dNTP mix（2.5 mmol/L）4 μL、ALL-GCV3F（10 μmol/L）和ALL-V3R（10 μmol/L）各1 μL、rTaq酶（5 U/μL）0.4 μL、DNA模板1 μL，用無菌水將體系補齊至50 μL，混合均勻后置于PCR儀中94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火1 min、72 ℃延伸90 s，循環(huán)30 次；然后72 ℃完全延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的聚丙烯酰胺凝膠（丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺體積比37.5∶1）（變性劑范圍35%～52%）中進(jìn)行檢測，電泳條件為：0.5×TAE緩沖溶液，恒溫60 ℃，120 V運行78 min后80 V維持13 h。電泳結(jié)束后將銀染法染色的凝膠掃描成像，挑選優(yōu)勢條帶切膠回收，然后使用不帶GC夾子的引物進(jìn)行擴(kuò)增，清潔，連接pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，挑選2 株單菌落進(jìn)行陽性克隆鑒定，并將菌液送至測序公司測序[28]。序列置于NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對。

1.3.3 細(xì)菌MiSeq高通量測序分析

參照沈馨等[29]的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL體系：5×FastPfu Buffer 4 μL、dNTP mix（2.5 mmol/L）2 μL、引物338F（5 μmol/L）和806R（5 μmol/L）各0.8 μL、rTaq（5 U/μL）0.4 μL、DNA模板10 ng，剩余體積用無菌水補齊；反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃、3 min；95 ℃、30 s；55 ℃、30 s；72 ℃、45 s；30 次循環(huán)；72 ℃、10 min。擴(kuò)增合格的產(chǎn)物寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。序列下機后需進(jìn)行拼接和質(zhì)量控制，參照郭壯等[30]的方法刪除不合格序列后，再根據(jù)各序列標(biāo)簽將序列劃分至各樣本中。利用QIIME數(shù)據(jù)分析平臺[31]劃分操作分類單元（operational taxonomic units，OTU），再從每個OTU中挑選代表序列，于Greengenes[32]和RDP（Ribosomal Database Project）[33]數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，確定其微生物分類水平，并計算各樣品α多樣性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

DGGE條帶序列使用BioEdit 7.0.9軟件（美國Tom Hall公司）進(jìn)行拼接和引物切除，然后將處理好的序列置于NCBI數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行比對；使用OriginPro 2017軟件（美國OriginLab公司）繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 臘肉樣品細(xì)菌的PCR-DGGE分析

圖1 臘肉樣品中細(xì)菌的DGGE分析結(jié)果Fig.1 DGGE fingerprint of bacteria in Chinese bacon samples

由圖1可知，經(jīng)DGGE后不同樣品泳道中出現(xiàn)數(shù)量、亮度不一的條帶，從中共挑選出9 條優(yōu)勢條帶，其中條帶7、8為所有樣品的共有條帶，條帶1、2、3、5為部分樣品共有條帶，而條帶4、6分別為樣品LR2和LR3的特有條帶。

表1 臘肉樣品細(xì)菌DGGE優(yōu)勢條帶的比對分析結(jié)果Table 1 Sequence alignment of domain DGGE bands of Chinese bacon samples

由表1可知，各優(yōu)勢條帶與其近源種的相似度均在99%以上。經(jīng)比對，條帶2、4和8分別為馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum）、小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）和香料葡萄球菌（Staphylococcus condimenti），均隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus）；條帶1和6分別為北極冷桿菌（Psychrobacter arcticus）和糞嗜冷桿菌（Psychrobacter faecalis），均隸屬于嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）；條帶3和5分別為植物乳桿菌阿根廷亞種（Lactobacillus plantarum subsp. argentoratensis）和食淀粉乳桿菌（Lactobacillus amylovorus），均隸屬于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）；條帶7為食鹿角菜假交替單胞菌（Pseudoalteromonas carrageenovora），隸屬于假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）。結(jié)合圖1分析可知，臘肉中的細(xì)菌主要為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas），且樣品中均含有香料葡萄球菌（Staphylococcus condimenti）和食鹿角菜假交替單胞菌（Pseudoalteromonas carrageenovora），而樣品LR2和LR3中的特有細(xì)菌分別為小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）和糞嗜冷桿菌（Psychrobacter faecalis）。全拓等[34]的研究結(jié)果與本研究相同，他們通過采用純培養(yǎng)的方法對川渝兩地臘肉的優(yōu)勢菌多樣性進(jìn)行解析發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌是臘肉產(chǎn)品貨架期內(nèi)的優(yōu)勢菌。

2.2 臘肉樣品細(xì)菌的MiSeq高通量測序分析

采用MiSeq高通量測序技術(shù)從5 個樣品中檢測到的序列在100%相似度下可劃分為103 157 條，在97%的相似度下又可將這些序列劃分至8 876 個OTU中，從各OTU中挑選代表性序列，與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對可判定其微生物學(xué)分類定位。

表2 樣品序列微生物分類地位統(tǒng)計Table 2 Number of identifiable units at different taxonomical levels

由表2可知，不同樣本中檢測到的細(xì)菌條帶數(shù)量有所差異。經(jīng)比對，樣品中各微生物分類水平數(shù)量亦不相同，樣品LR4中條帶數(shù)量和OTU最多，而樣品LR3中微生物的門、綱、目、科、屬各級數(shù)量均較其他樣品多。采用α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，在條帶數(shù)量為33 210 條時，超Ⅰ指數(shù)和香農(nóng)指數(shù)最大的為樣品LR4，最小的為LR1，說明樣品LR4中細(xì)菌總數(shù)及豐富度最高，而LR1中最低，這與DGGE分析結(jié)果一致。進(jìn)一步在門水平分析樣品中的細(xì)菌信息。

圖2 臘肉樣品細(xì)菌門水平的平均相對含量分析Fig.2 Comparative analysis of the average relative contents of bacterial phyla in Chinese bacon samples

由圖2可知，從5 個臘肉樣品中檢測出硬壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、梭桿菌門（Fusobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）6 個細(xì)菌門，其中平均相對含量大于1.0%的為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），且二者的累積平均相對含量高達(dá)99.11%。異常球菌-棲熱菌門為樣品LR3的特有細(xì)菌門，平均相對含量僅為0.60%；梭桿菌門為樣品LR4中的特有細(xì)菌門，平均相對含量僅為0.41%。

圖3 臘肉樣品中優(yōu)勢細(xì)菌屬的平均相對含量分析Fig.3 Comparative analysis of the average relative contents of dominant bacterial genera in Chinese bacon samples

進(jìn)一步對99 個細(xì)菌屬中平均相對含量大于1.0%的細(xì)菌屬進(jìn)行分析。由圖3可知，臘肉中平均相對含量大于1.0%的細(xì)菌屬分別為葡萄球菌屬（Staphylococcus，40.18%）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter，24.02%）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas，9.37%）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix，8.53%）、科貝特氏菌屬（Cobetia，4.71%）和不動細(xì)菌屬（Acinetobacter，2.31%），僅有5.54%的序列不能鑒定到屬水平。采用MiSeq高通量測序技術(shù)亦檢測出乳酸菌屬（Lactobacillus），其平均相對含量為0.27%，但PCR-DGGE未檢測出隸屬于科貝特氏菌屬（Cobetia）和不動細(xì)菌屬（Acinetobacter）等菌屬的細(xì)菌，這可能與其擴(kuò)增所用引物或這些菌屬的豐度等因素有關(guān)。

圖4 臘肉樣品中OTU出現(xiàn)次數(shù)的統(tǒng)計分析Fig.4 Distribution of OTU as a function of their prevalence in Chinese bacon samples

表2表明不同樣品中OTU數(shù)量亦不相同。由圖4可知：僅出現(xiàn)1 次的OTU，即樣品中特有OTU占總OTU數(shù)的80.26%，其所包含的序列有16 520 條，占總序列數(shù)的7.36%；出現(xiàn)5 次的OTU，即5 個樣品中共有的OTU僅占OTU總數(shù)的2.84%，但其所包含的序列有166 546 條，占OTU總數(shù)的74.22%，說明臘肉樣品細(xì)菌菌群中部分為某些樣品中特有的，但數(shù)量較少，含量最多的主要為共有菌群。

圖5 臘肉樣品中核心優(yōu)勢OTU的相對含量分析Fig.5 Comparative analysis of the relative contents of the dominant core bacterial OTUs

將樣品中共有且相對含量大于1.0%的OTU定義為核心優(yōu)勢OTU。由圖5可知，臘肉中核心優(yōu)勢OTU有16個，其中OTU5583、OTU5308、OTU8865、OTU7670、OTU1632、OTU2776、OTU1595、OTU367、OTU5460和OTU1519隸屬于葡萄球菌屬（Staphylococcus），OTU687、OTU3304、OTU5538和OTU8970隸屬于嗜冷桿菌屬（Psychrobacter），OTU4150和OTU514分別隸屬于和環(huán)絲菌屬（Brochothrix）。由此可見，臘肉樣品中含有大量核心優(yōu)勢細(xì)菌菌群，且主要為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）和環(huán)絲菌屬（Brochothrix）。

3 結(jié) 論

采用PCR-DGGE和MiSeq高通量測序技術(shù)相結(jié)合的方法對恩施地區(qū)臘肉細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析。PCR-DGGE結(jié)果表明，臘肉中的細(xì)菌主要為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas），且樣品中均含有香料葡萄球菌（Staphylococcus condimenti）和食鹿角菜假交替單胞菌（Pseudoalteromonas carrageenovora）；MiSeq高通量測序技術(shù)結(jié)果表明，臘肉中平均相對含量大于1.0%的細(xì)菌屬為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、環(huán)絲菌屬（Brochothrix）、科貝特氏菌屬（Cobetia）和不動細(xì)菌屬（Acinetobacter）。由此可見，2 種技術(shù)均表明恩施地區(qū)臘肉中的優(yōu)勢細(xì)菌為葡萄球菌屬（Staphylococcus）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）。