納米銀的遷移轉(zhuǎn)化對環(huán)境微生物毒性的影響

盧雪蓉，馮曉麗，劉朝瑩，李潛

江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013

隨著社會工業(yè)化的進程，納米材料的生產(chǎn)和使用已被廣泛應(yīng)用于化工、電子、醫(yī)療、環(huán)境治理等相關(guān)領(lǐng)域，并呈現(xiàn)逐年增長的趨勢[1]。其中，納米銀由于優(yōu)良的抑菌性能而被廣泛應(yīng)用于紡織品、個人護理品、醫(yī)療器械、包裝甚至食品添加劑等各類產(chǎn)品中[2-3]。據(jù)統(tǒng)計，全球AgNPs用量占納米材料總用量的50%[4]。然而，納米銀產(chǎn)品在生產(chǎn)、運輸、洗滌、侵蝕、丟棄的過程中將不可避免地釋放到自然環(huán)境中并對生態(tài)系統(tǒng)中的微生物產(chǎn)生嚴(yán)重影響[5-6]。AgNPs的抑菌機制主要歸因于釋放的Ag+及誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)所引發(fā)的蛋白失活、細(xì)胞膜破損、能量代謝受阻、DNA損傷等毒理效應(yīng)。但在實際環(huán)境暴露過程中，AgNPs易受到天然有機物質(zhì)(natural organic matter, NOM)、pH值、溶解氧(dissolved oxygen, DO)、陰/陽離子、光照等環(huán)境因素以及自身粒徑大小、形貌、表面包埋劑等理化性質(zhì)的影響，導(dǎo)致其出現(xiàn)溶解、團聚、沉淀等賦存狀態(tài)的改變，并進而影響其微生物毒性。因此，AgNPs在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化行為及其對環(huán)境微生物毒性的影響已成為當(dāng)前環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點。本文擬對近年來國內(nèi)外的相關(guān)研究進行概述，旨在為我國在該領(lǐng)域的研究提供參考。

1 AgNPs在環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化行為(Migration and transformation of AgNPs in the environment)

1.1 環(huán)境中AgNPs的來源

近年來，AgNPs被大規(guī)模生產(chǎn)及廣泛應(yīng)用于日常生活，因此AgNPs在其生產(chǎn)和使用過程中將不可避免地釋放到環(huán)境中[7]。據(jù)Gottschalk等[8]調(diào)查發(fā)現(xiàn)絕大部分AgNPs是在使用過程中由于機械磨損、材料老化、廢水排放等原因而被釋放到環(huán)境中。不過，環(huán)境中的Ag+經(jīng)過一系列的生物化學(xué)過程也可形成AgNPs。Li等[9]證實胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)中的一些還原性基團能導(dǎo)致Ag+還原；Yin等[10]報道光照條件下自然環(huán)境中NOM可充當(dāng)光敏劑和穩(wěn)定劑以促進Ag+還原；Wang等[11]發(fā)現(xiàn)厭氧條件下電化學(xué)活性細(xì)菌Shewanellaoneidensis能介導(dǎo)AgNPs的生物合成。除此之外，還有少量AgNPs可來源于火山噴發(fā)、巖石風(fēng)化、深海熱泉等自然活動[7]。

1.2 AgNPs在環(huán)境中的遷移

環(huán)境中人為釋放或者自然形成的AgNPs會在大氣、土壤、水體等環(huán)境介質(zhì)中發(fā)生遷移。AgNPs在環(huán)境中的遷移取決于其自身理化特性(粒徑大小、形貌、表面包埋劑等)和不同的環(huán)境因素(NOM、pH值、DO、電解質(zhì)濃度及類型、光照等)。

在大氣中，AgNPs可以氣溶膠的形式均勻分散，也可附著于塵埃顆粒表面，從而嚴(yán)重影響空氣質(zhì)量甚至引起一系列的呼吸道疾病。通常AgNPs在空氣中不能長期穩(wěn)定存在，最終會由于自身團聚或者降雨而匯入土壤和水體環(huán)境[12]。

在土壤環(huán)境中，AgNPs的遷移行為主要分為3種：重力沉降、滯留、自由擴散，這取決于AgNPs自身特性和土壤的物理化學(xué)性質(zhì)[13]。AgNPs粒徑對其土壤遷移過程有重要影響。對于粒徑較大的AgNPs而言，重力沉降和滯留是主要的遷移行為。除少部分隨著水流滲透進入地下水，大部分AgNPs則被過濾攔截于土壤中；而粒徑較小的AgNPs則較易在土壤中自由遷移[14]。土壤本身的理化特性也會制約AgNPs的遷移過程。研究發(fā)現(xiàn)AgNPs在粘質(zhì)土中易滯留，而在沙質(zhì)土中遷移最快[15]。目前許多研究利用玻璃微珠、石英砂等多孔介質(zhì)模擬土壤環(huán)境來探究AgNPs在土壤中的遷移行為[16-17]。但此類模擬實驗因其自身的局限性，常難以準(zhǔn)確反映AgNPs在實際土壤中的遷移過程[14]。

關(guān)于AgNPs在水體環(huán)境中的遷移，目前的研究著重從自然水體和廢水體系兩方面闡述。自然水體環(huán)境中，一部分環(huán)境釋放的AgNPs隨著地表徑流匯入江河湖?；蛘邼B透進入地下水[18]。而另一部分則隨著生活廢水和工業(yè)廢水的排放而進入污水管道中。除少部分沉積于管道中或吸附于生物膜上，絕大部分AgNPs最終進入污水處理廠[19]。

1.3 AgNPs在環(huán)境中的賦存狀態(tài)及其對微生物毒性的影響

1.3.1 表面性質(zhì)改變

為了便于AgNPs的分散及實現(xiàn)其功能化，工業(yè)生產(chǎn)一般會選擇聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙二醇(PEG)、分枝狀聚乙烯亞胺(BPEI)、檸檬酸鈉、硼氫化鈉等作為其包埋劑。其中，大分子親水聚合物PVP、PVA和PEG利用空間位阻使AgNPs穩(wěn)定。小分子帶電荷的檸檬酸鈉、硼氫化鈉利用靜電力使AgNPs穩(wěn)定。而BPEI利用空間位阻和靜電力的共同作用使其穩(wěn)定[20]。AgNPs在環(huán)境遷移的過程中，表面原有的包埋劑常因吸附解離或降解脫落，而被環(huán)境中廣泛存在的腐殖質(zhì)(humic acid, HA)、黃腐酸(fulvic acid, FA)、EPS、蛋白質(zhì)等天然有機質(zhì)取代或者二次包埋。據(jù)Li等[21]和Yu等[22]報道，PVP和檸檬酸鹽包埋劑在太陽光和紫外光照射下易發(fā)生光解[21-22]。Levak等[23]研究發(fā)現(xiàn)牛血清蛋白取代檸檬酸包埋劑吸附于AgNPs表面，使得AgNPs更穩(wěn)定地存在。Gunsolus等[24]報道NOM與AgNPs之間相互作用取決于NOM化學(xué)組成以及AgNPs與包埋劑結(jié)合的緊密程度。富含S、N元素的NOM更易吸附于AgNPs表面形成二次包埋，因為S、N位點與AgNPs表面有較強的親和力；NOM更易取代與AgNPs結(jié)合較疏松的包埋劑。Sanchez-Cortes等[25]報道pH值、NOM分子量及AgNPs包埋劑類型可影響NOM吸附能力。中性pH值條件下，HA利用芳烴位點吸附于檸檬酸鹽包埋的納米銀(Cit-AgNPs)，酸性pH值條件下，則通過羧酸基團位點吸附；pH值為7時，只有高分子量HA(100～300 kDa)可緊緊吸附于Cit-AgNPs，而低分子量FA(0.5～1 kDa)傾向于吸附在NaBH4-AgNPs表面。Badawy等[26]發(fā)現(xiàn)離子強度、pH值對PVP包埋劑沒有影響，但在高離子強度及低pH值條件下檸檬酸鹽包埋劑穩(wěn)定性變差。相比之下，PVP作為空間位阻型包埋劑抗外界干擾的能力更強。

表面包埋劑能通過靜電作用力和空間位阻調(diào)控AgNPs的穩(wěn)定性及顆粒溶解速率，從而對AgNPs微生物毒性產(chǎn)生影響[27]。Badawy等[28]發(fā)現(xiàn)表面包埋劑可以改變AgNPs表面電荷，進而影響AgNPs對Bacillus的毒性，表面帶負(fù)電荷的Cit-AgNPs(ζ=-38 mV)的毒性最小，表面帶正電荷的BPEI-AgNPs(ζ=+40 mV)的毒性最大，未包埋的AgNPs(ζ=-22 mV)和PVP-AgNPs(ζ=-10 mV)毒性介于二者之間。

1.3.2 團聚與沉淀

團聚包括均質(zhì)團聚和異質(zhì)團聚。均質(zhì)團聚是指理化性質(zhì)相同的納米粒子之間的團聚，異質(zhì)團聚是指理化性質(zhì)不同的粒子之間的團聚。而團聚最終誘導(dǎo)納米材料沉淀[29]。

AgNPs均質(zhì)團聚受很多環(huán)境因素的影響，包括：AgNPs粒徑、形貌、pH值、電解質(zhì)濃度及類型等。因為比表面積越大表面能越大，穩(wěn)定性也隨之變差，相對于大粒徑的AgNPs，小粒徑AgNPs更易團聚；相對于AgNPs，銀納米線更易穩(wěn)定地存在[30-31]。pH值對Cit-AgNPs穩(wěn)定性影響較大，能通過降低其顆粒表面的ζ電勢而導(dǎo)致納米顆粒團聚[26]。而電解質(zhì)濃度和類型也會改變AgNPs表面的電荷類型，并進而影響其ζ電勢。相比于一價型的電解質(zhì)，二價型的電解質(zhì)能更有效地降低Cit-AgNPs的穩(wěn)定性[32]。雖然目前大多數(shù)研究都圍繞AgNPs均質(zhì)團聚展開，但AgNPs與環(huán)境中存在的膠體相互作用而導(dǎo)致的異質(zhì)團聚也不可忽視。Zhou等[33]發(fā)現(xiàn)在pH值為4的條件下帶負(fù)電荷的AgNPs能與邊緣帶正電荷的片狀蒙脫石發(fā)生共團聚，使其穩(wěn)定性下降，并隨著時間的推移最終形成沉淀。

AgNPs團聚通常會導(dǎo)致其對微生物毒性的降低。一方面團聚會減少AgNPs與細(xì)胞表面接觸的有效位點，另一方面AgNPs團聚也會顯著降低其溶解釋放Ag+的速率。Li等[34]研究發(fā)現(xiàn)吐溫包埋處理的AgNPs相比于未包埋的AgNPs及檸檬酸鹽包埋的AgNPs更易穩(wěn)定地分散，并具有更快的離子釋放速率，從而對水體微生物導(dǎo)致更高的毒性。

1.3.3 氧化溶解

近年的研究表明AgNPs對微生物產(chǎn)生毒性主要歸咎于其釋放出Ag+。而水體中Ag+首先來源于AgNPs氧化溶解。目前，AgNPs在環(huán)境中的氧化溶解行為成為研究熱點。AgNPs發(fā)生氧化溶解分為兩步：

4 Ag(0)+Q2=2 Ag2O

(1)

2 Ag2O+4 H+=4 Ag++2 H2O

(2)

O2和H+都參與了AgNPs的氧化溶解，因而水體DO和pH對AgNPs的溶解具有重要影響。酸性和有氧條件會加速AgNPs的溶解。AgNPs自身的粒徑大小會影響其比表面積，從而影響其在水體中的穩(wěn)定性。Peretyazhko等[35]報道，不管是中性還是酸性條件下，AgNPs的溶解速率隨粒徑的增加而減小。而溫度、光照、天然有機物質(zhì)等環(huán)境因素也能影響AgNPs的溶解。Liu等[36]報道，AgNPs的溶解速率隨溫度的升高而增加。Shi等[37]發(fā)現(xiàn)吸附于AgNPs表面的Ag+能在光照條件下重新還原為Ag單質(zhì)。Liu等[38]發(fā)現(xiàn)含有半胱氨酸和谷胱甘肽等含有還原性硫醇基的有機物可以還原AgNPs表面具有氧化傾向的位點。而Gondikas等[39]卻報道半胱氨酸可以促進Cit-AgNPs和PVP-AgNPs溶解。這二者矛盾的結(jié)果可能是由于不同的檢測方法所導(dǎo)致。Liu等[38]是利用銀離子選擇電極直接測定溶解銀。而Gondikas等[39]則是先將樣品過濾酸化后用ICP-MS檢測溶解銀。

圖1 環(huán)境因素對AgNPs賦存狀態(tài)轉(zhuǎn)化的影響Fig. 1 Effect of environmental factors on the transformation of AgNPs

AgNPs氧化溶解所釋放的Ag+是導(dǎo)致微生物毒性的關(guān)鍵因素。Chen等[4]研究表明氧氣能促進Ag+的釋放，導(dǎo)致好氧條件下AgNPs對Pseudomonasaeruginosa的毒性要高于厭氧條件下的毒性。Kittler等[40]報道老化的AgNPs溶膠毒性高于新鮮制備的AgNPs毒性，因為存儲時間的增加導(dǎo)致其溶解釋放Ag+。

1.3.4 氯化

1.3.5 硫化

污水處理系統(tǒng)中的生物厭氧代謝會產(chǎn)生大量的S2-。這導(dǎo)致AgNPs在環(huán)境遷移轉(zhuǎn)化過程中將不可避免地發(fā)生硫化反應(yīng)。AgNPs的硫化既可以在好氧條件下發(fā)生，也可以在厭氧條件下發(fā)生，其機制取決于水體中S2-的濃度。高濃度條件下，S2-能直接與AgNPs反應(yīng)。而低濃度條件下，S2-則與AgNPs溶解產(chǎn)生的Ag+相結(jié)合[47-49]。由于產(chǎn)生的Ag2S具有極低的溶解度(Ksp=5.92×10-51)，這使得AgNPs經(jīng)硫化后其對微生物的毒性作用得到顯著緩解[50-51]。此外，在S2-存在條件下，AgCl(s)因其溶解度(Ksp=2×10-10)遠(yuǎn)大于Ag2S，所以會最終轉(zhuǎn)化為溶解度更小的Ag2S，從而影響了AgNPs生物毒性(如圖1)。

2 AgNPs對微生物的毒性效應(yīng)及毒理機制(Toxic effect and toxic mechanism of AgNPs towards microorganism)

2.1 微生物毒性效應(yīng)

AgNPs作為一種廣譜性的抗菌劑，雖然能有效抑制革蘭氏陰性菌和陽性菌的生長[52]，但對其抗菌效能還存在一些爭議。據(jù)Taglietti等[53]報道，革蘭氏陰性菌E.coli對谷胱甘肽包埋的AgNPs耐受能力要低于革蘭氏陽性菌Staphylococcusaureus。這可能是因為S.aureus較厚的細(xì)胞壁阻止了AgNPs滲透進入細(xì)胞質(zhì)。然而，Yoon等[54]卻發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的脂多糖能提供菌體對AgNPs的抗性。這使得革蘭氏陰性菌E.coli和S.oneidensis對AgNPs的耐受能力要高于革蘭氏陽性菌B.subtilis。除了常見的抑菌作用，AgNPs還被發(fā)現(xiàn)能刺激硫酸鹽還原菌Desulfovibriovulgaris的增殖[55]。另外目前評估AgNPs毒性的方法主要通過生長曲線、平板涂布等依賴于細(xì)菌生長的評估方法。但是K?nigs等[56]發(fā)現(xiàn)AgNPs處理能夠誘導(dǎo)P.aeruginosa進入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but non-culturable, VBNC)。這些結(jié)果顯示目前人們對AgNPs微生物毒性的認(rèn)識還有待進一步深入。

除純菌外，近來AgNPs對微生物混合菌群的影響也受到日益重視。但是此方面的研究還有待進一步的加強。Liang等[57]發(fā)現(xiàn)在活性污泥處理系統(tǒng)中，1 mg·L-1AgNPs對反應(yīng)器硝化抑制率達(dá)到41.4%。對其微生物群落結(jié)構(gòu)的分析表明AgNPs會導(dǎo)致氨氧化細(xì)菌、亞硝酸鹽氧化菌、硝化螺菌種群數(shù)明顯減少，硝化菌屬基本消失。Zhang等[58]研究發(fā)現(xiàn)0.1 mg·L-1AgNPs長期處理對膜生物反應(yīng)器的效能和細(xì)胞活性沒有顯著影響，而且硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定。這可能是由于活性污泥能包裹AgNPs并吸附AgNPs釋放的Ag+，從而有效地降低其毒性作用。

2.2 復(fù)合毒性

實際環(huán)境中除了AgNPs外，還存在其他的污染物質(zhì)。因而，近年來關(guān)于AgNPs與其他環(huán)境污染物的復(fù)合毒性效應(yīng)受到日益重視。抗生素是一種重要環(huán)境污染物質(zhì)。通過各種途徑釋放到環(huán)境中的抗生素能夠與AgNPs協(xié)同作用，增強對細(xì)菌的抑制作用。四環(huán)素和慶大霉素能夠改變AgNPs的表面電性，促進AgNPs與菌體結(jié)合，并會加速Ag+釋放[59-60]；氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素與AgNPs的聯(lián)用會抑制病原菌細(xì)胞膜的合成，從而降低病原菌的耐受能力[61]。此外，廣泛使用的洗滌劑也能影響AgNPs的抑菌活性。Kvitek等[62]發(fā)現(xiàn)陰離子型表面活性劑十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)不僅能使AgNPs更穩(wěn)定地分散，而且還能增加細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞對AgNPs更敏感，從而顯著提高AgNPs的抗菌性能。另外，Zhao等[63]報道紫外光和AgNPs協(xié)同處理能顯著增強對E.coli的抑制效果；Wilke等[64]研究發(fā)現(xiàn)AgNPs和納米TiO2混合物在模擬太陽光照條件下可提高光催化活性(AgNPs作為光敏劑促進納米TiO2的可見光響應(yīng))和過氧化氫產(chǎn)量，導(dǎo)致協(xié)同毒性。

2.3 毒理機制

AgNPs對微生物的毒性效應(yīng)已經(jīng)毋庸置疑。雖然迄今為止對AgNPs的毒理機制未完全清楚，但釋放的Ag+以及產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)被普遍認(rèn)為是最重要的2個因素(圖2)。

2.3.1 Ag+釋放

眾多研究顯示Ag+釋放是造成AgNPs毒性的直接因素。Ag+不但能與膜蛋白中的硫醇基反應(yīng)，使得酶失活，繼而阻礙跨膜電子運輸，還能與DNA相結(jié)合，造成DNA損傷并阻礙DNA復(fù)制，甚至Ag+還能影響細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和通透性[65]。Mishra等[66]報道溶解釋放的Ag+決定了AgNPs對B.subtilis的毒性，且Ag+進入胞內(nèi)并被轉(zhuǎn)化為Ag2O；Katsumiti等[67]比較了不同粒徑AgNPs和Ag+的毒性，結(jié)果顯示離子態(tài)的Ag是造成AgNPs毒性的主要因素；Sotiriou等[68]研究表明Ag/SiO2納米顆粒對E.coli的毒性大小與溶解的Ag+濃度呈正相關(guān)，小粒徑納米顆粒釋放的Ag+濃度高，抗菌活性高，大粒徑納米顆粒反之。

2.3.2 活性氧自由基產(chǎn)生

AgNPs不僅可以產(chǎn)生胞外ROS，還能誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。胞內(nèi)ROS的累積能誘發(fā)蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞膜損傷、DNA損傷等生理活動，并最終導(dǎo)致微生物死亡。Guo等[71]通過向反應(yīng)體系中加入抗氧劑維生素C證明了AgNPs毒性與ROS緊密相關(guān)；Joshi等[72]構(gòu)建了缺乏Ag+流出系統(tǒng)和氧化應(yīng)激抵抗系統(tǒng)的E.coli突變體，并發(fā)現(xiàn)突變體對AgNPs誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS更為敏感。Long等[73]發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)體系中添加Ag+絡(luò)合劑以及ROS清除劑可以消除AgNPs對E.coli的毒性，且添加Ag+絡(luò)合劑能使胞內(nèi)ROS含量降低到對照水平。這表明AgNPs釋放的Ag+能誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，從而導(dǎo)致AgNPs毒性。

雖然Ag+和ROS是導(dǎo)致AgNPs毒性的關(guān)鍵因素，但是其他因素也對納米銀的毒性機制評估產(chǎn)生影響。例如，不同的受試菌株對AgNPs脅迫的抵御機制可能存在差異。Mishra等[66]研究表明Ag+導(dǎo)致AgNPs對B.subtilis的毒性，而Joshi等[72]認(rèn)為ROS脅迫導(dǎo)致AgNPs對E.coli突變體的毒性。另外，AgNPs表面包埋劑也可能影響其毒性機制。Zhang和Li[69-70]研究結(jié)果表明有無包埋劑或者包埋劑類型會影響AgNPs是否光激發(fā)產(chǎn)生ROS及ROS種類，從而影響AgNPs毒理機制。此外，復(fù)雜環(huán)境因素對AgNPs毒理機制具有重要影響，此方向的研究報道尚有待進一步加強。

圖2 AgNPs微生物毒性機制Fig. 2 Toxic mechanism of AgNPs towards microorganism

3 結(jié)語(Summary)

納米銀材料的廣泛應(yīng)用已經(jīng)給人類生產(chǎn)生活帶來了諸多便利。但是其日益增強的環(huán)境釋放也對生態(tài)環(huán)境，尤其是對單細(xì)胞的環(huán)境微生物帶來潛在危害。在實際復(fù)雜環(huán)境多因素條件下，AgNPs環(huán)境遷移轉(zhuǎn)化過程以及對微生物毒性效應(yīng)影響的研究尚有待加強：AgNPs在土壤中遷移轉(zhuǎn)化的模擬實驗應(yīng)著重研究復(fù)雜環(huán)境因素的影響，以反映AgNPs在實際土壤中遷移的真實狀況；AgNPs低劑量刺激效應(yīng)以及誘導(dǎo)進入VBNC狀態(tài)的研究尚需深入開展；AgNPs和其他典型環(huán)境污染物的復(fù)合毒性效應(yīng)研究需要進一步探討；不同微生物對AgNPs毒性的耐受機制的研究有待進一步加強；復(fù)雜環(huán)境因素對于AgNPs毒理機制的影響應(yīng)廣泛開展。

致謝：感謝江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院肖翔副教授在文章修改中給予的幫助。