磺胺類化合物對(duì)大腸桿菌突變QSAR預(yù)測(cè)模型初探

巫曉丹，馬清萍，宋春磊，林志芬,#，印春生,*

1. 上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306 2. 同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海污染控制與生態(tài)安全研究院，上海 200092

抗生素自發(fā)現(xiàn)以來，被大量地應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)和畜牧養(yǎng)殖等領(lǐng)域[1]。然而，抗生素濫用造成了一定的危害，引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注，如水產(chǎn)養(yǎng)殖中，磺胺類抗生素的濫用導(dǎo)致水產(chǎn)品體內(nèi)藥物殘留，人長(zhǎng)期食用造成潛在危害，產(chǎn)生排尿和造血紊亂等副作用[2]，其在環(huán)境中的長(zhǎng)期存在脅迫微生物產(chǎn)生耐藥性，通過食物鏈傳遞到人類，威脅人類生命安全[3]。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)致病菌耐藥性是指導(dǎo)抗生素合理使用的關(guān)鍵[4-5]。

藥敏試驗(yàn)是目前檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的常規(guī)方法[6]，包括肉湯稀釋法、瓊脂稀釋法及E-test實(shí)驗(yàn)等，能夠檢測(cè)藥物的最小抑菌濃度，指導(dǎo)用藥劑量，但許多生長(zhǎng)慢或不容易培養(yǎng)的細(xì)菌不能通過藥敏試驗(yàn)進(jìn)行耐藥性檢測(cè)[5]。檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的方法還包括聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)、基因芯片、微流體芯片和全基因組測(cè)序等，以上幾種方法都有較高的敏感性和特異性，可以在臨床中減少經(jīng)驗(yàn)性治療，提高療效[5]。但是這些方法存在的一些不足也不容忽視，如它們檢測(cè)手段復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)程度有較高要求等[5]。因此，需要研究一種簡(jiǎn)單方便的可預(yù)測(cè)模型。

定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)是一種借助分子的理化性質(zhì)參數(shù)或結(jié)構(gòu)參數(shù)，應(yīng)用理論計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析工具，定量研究有機(jī)小分子與生物大分子相互作用、有機(jī)小分子在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝等生理相關(guān)性質(zhì)的方法，具有計(jì)算量小、預(yù)測(cè)能力好的優(yōu)點(diǎn)，是應(yīng)用最為廣泛的藥物分子設(shè)計(jì)的預(yù)測(cè)計(jì)算方法。目前QSAR已經(jīng)在醫(yī)藥、化學(xué)、環(huán)境科學(xué)以及毒理學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用[7]，主要利用QSAR的預(yù)測(cè)功能，包括預(yù)測(cè)化合物的單一毒性與混合物的聯(lián)合毒性[8-9]，預(yù)測(cè)的參數(shù)有化合物的理化參數(shù)、量化參數(shù)、生物參數(shù)等，如Zou等[10]建立了基于Ebinding的QSAR模型，預(yù)測(cè)典型抗生素慢性聯(lián)合毒性，Li等[11]利用Ebinding構(gòu)建QSAR模型，預(yù)測(cè)多溴聯(lián)苯醚毒性。值得注意的是，突變是生物效應(yīng)的一方面，因此如果能將QSAR拓展用于突變效應(yīng)方面的預(yù)測(cè)建模，可能建立一種突變效應(yīng)方面的預(yù)測(cè)方法。

本研究以經(jīng)典模式生物大腸桿菌(E.coli)作為受試生物，選取10種磺胺(SAs)作為研究對(duì)象，測(cè)定了SAs單一暴露時(shí)對(duì)E.coli突變效應(yīng)，采用lgRC0-1(突變促進(jìn)率為1%時(shí)最低可觀測(cè)突變促進(jìn)效應(yīng)濃度)、lgRC0-2(最高可觀測(cè)突變促進(jìn)效應(yīng)濃度)、RCS(突變促進(jìn)濃度跨度，即lgRC0-2～lgRC0-1)、PA(突變促進(jìn)面積)、Pmax(突變促進(jìn)率最大值)和lgRCmax(Pmax對(duì)應(yīng)的濃度)為參數(shù)，構(gòu)建突變效應(yīng)的QSAR模型，以期為抗生素使用的環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)工作以及對(duì)藥物的設(shè)計(jì)提供相關(guān)指導(dǎo)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑

所用試劑均購(gòu)于Sigma-Aldrich化學(xué)制品有限公司(St. Louis, MO, USA)，純度均≥99%，使用二甲基亞砜(DMSO)作為助溶劑，其濃度低于0.1%，所使用的試劑具體信息見表1。

1.2 E. coli的培養(yǎng)

菌株E.coli(MG 1655)購(gòu)自普如汀生物技術(shù)有限公司。取F3菌種接入5 mL液體培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫條件下震蕩培養(yǎng)6 h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，稀釋或離心濃縮后，調(diào)整OD600為0.5±0.01，然后使用1% NaCl稀釋105倍，磁力攪拌30 min左右使細(xì)菌處于相同的生長(zhǎng)周期即為可直接用于暴露實(shí)驗(yàn)的工作菌液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

取待測(cè)化合物用1% NaCl稀釋成等對(duì)數(shù)梯度系列濃度，每個(gè)濃度梯度點(diǎn)至少設(shè)置32個(gè)平行。震蕩搖勻后，在37 ℃、180 r·min-1的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)12 h后，震蕩混勻，從中取30 μL至含40 mg·L-1利福平的抗性平板培養(yǎng)基上，倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h，記錄菌落數(shù)。將系列稀釋后的菌液再次稀釋106倍，從中取30 μL至不含抗生素的平板培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)12 h，記錄菌落數(shù)并計(jì)算出稀釋前的總菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

化合物對(duì)E.coli突變效應(yīng)由促進(jìn)率表述，如式(1)所示：

(1)

式中，P表示促進(jìn)率，f0、fi分別表示對(duì)照組、第i個(gè)測(cè)試樣的總菌數(shù)或突變次數(shù)。

表1 所用化合物及其相關(guān)參數(shù)Table 1 The relative compounds and their parameters

圖1 磺胺(SAs)單一暴露對(duì)E. coli的生長(zhǎng)及突變的影響注：A～J分別表示SCP、SMX、SDX、SMP、SMR、SMZ、SD、SPY、SIZ、SM；■突變率促進(jìn)率；突變次數(shù)促進(jìn)率；─突變次數(shù)促進(jìn)率擬合曲線；突變次數(shù)；總菌數(shù)。Fig. 1 The effects of individual exposure of sulfonamides (SAs) on the growth and mutation of E. coliNote: A-J stand for SCP, SMX, SDX, SMP, SMR, SMZ, SD, SPY, SIZ and SM, respectively. ■Promoting rate of mutation rate; Promoting rate of mutation times; ─Fitting curves; Mutation times; Cells count.

以化合物濃度為橫坐標(biāo)，E.coli突變促進(jìn)率為縱坐標(biāo)，做散點(diǎn)圖，并使用Biphasic函數(shù)[12]對(duì)劑量-突變效應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合并作圖，如公式(2)所示：

(2)

式中，Amin、Amax1、Amax2、x0-1、x0-2、h1、h2均作為參數(shù)參與擬合。

使用Accelrys公司的Discovery Studio 3.1軟件計(jì)算了10種SAs與靶蛋白DHPS的結(jié)合能Ebinding，使用Gaussian 09軟件計(jì)算出了10種磺胺常見的物化參數(shù)如分子內(nèi)能E、分子極化率MP、能帶隙GAP(即最高占據(jù)分子軌道和最低未占分子軌道之間的能量差)、偶極矩DMG。

(3)

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 SAs單一暴露對(duì)E. coli的突變效應(yīng)

本文研究了10種SAs(SCP、SMX、SDX、SMP、SMR、SMZ、SD、SPY、SIZ、SM)對(duì)E.coli的突變作用，并根據(jù)Origin 8.0軟件中的Biphasic函數(shù)公式對(duì)劑量-突變效應(yīng)數(shù)據(jù)進(jìn)行了擬合，如圖1所示。

由圖1可知，SAs對(duì)E.coli的突變次數(shù)均有促進(jìn)作用，其中SD的最大促進(jìn)率最大，濃度為5.0×10-5mol·L-1時(shí)促進(jìn)率達(dá)到171.6%，最大促進(jìn)率由大到小依次為SD > SM > SMZ > SIZ >SPY > SMX > SMR > SMP > SCP > SDX。此外，每一個(gè)SAs的擬合參數(shù)數(shù)值及其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)偏差SD、相關(guān)系數(shù)R2，如表2所示。

2.2 SAs對(duì)E. coli的突變效應(yīng)的QSAR模型

2.2.1 SAs暴露對(duì)E. coli的突變參數(shù)

為了進(jìn)一步研究化合物濃度與突變之間的關(guān)系，本文根據(jù)擬合曲線計(jì)算出RC0-1(突變促進(jìn)率為1%時(shí)最低可觀測(cè)突變促進(jìn)效應(yīng)濃度)，RC0-2(最高可觀測(cè)突變促進(jìn)效應(yīng)濃度)，Pmax(突變促進(jìn)率最大值)，RCmax(Pmax對(duì)應(yīng)的濃度)，RCS(突變促進(jìn)濃度跨度，即lgRC0-2～lgRC0-1)及PA(突變促進(jìn)面積)，各指標(biāo)對(duì)應(yīng)位置如圖2所示，并計(jì)算具體數(shù)值如表2所示。

由圖1及表3可知，SAs能顯著性促進(jìn)E.coli的突變作用。其生長(zhǎng)、突變效應(yīng)濃度的大小關(guān)系為：lgRC0-2≈ lgEC50>lgRCmax>lgEC0>lgRC0-1。其中，lgEC0>lgRC0-1說明突變效應(yīng)的調(diào)控系統(tǒng)比生長(zhǎng)效應(yīng)的調(diào)控系統(tǒng)更為敏感，SAs在對(duì)生長(zhǎng)沒有抑制作用的濃度下也會(huì)促進(jìn)突變效應(yīng)。

2.2.2 構(gòu)建突變效應(yīng)的QSAR模型

Zou等[14]研究發(fā)現(xiàn)，可采用解離系數(shù)pKa表征抗生素進(jìn)入細(xì)胞的能力，結(jié)合能Ebinding表征抗生素與其靶蛋白的相互作用能力，半數(shù)效應(yīng)濃度EC50表征磺胺藥物毒性，建立QSAR模型，從而揭示抗生素結(jié)構(gòu)與其生物毒性的相關(guān)關(guān)系。基于該方法，本文嘗試建立QSAR模型，分析突變效應(yīng)參數(shù)與化合物物化性質(zhì)之間的內(nèi)在聯(lián)系。

采用SPSS軟件對(duì)SAs的突變效應(yīng)參數(shù)(lgRC0-1、lgRC0-2、lgRCmax、RCS、PA、Pmax，見表2)的數(shù)據(jù)和多種物化參數(shù)數(shù)據(jù)(Discovery Studio 3.1軟件和Gaussian 09軟件求得)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，將與突變效應(yīng)參數(shù)相關(guān)性較大的物化參數(shù)(結(jié)合能Ebinding、能帶隙GAP、分子極化率MP、分子內(nèi)能E、偶極矩DMG，|r|≥0.5)列于表4中，并通過SPSS軟件線性回歸模塊中的“逐步”方法建立SAs的物化參數(shù)對(duì)突變效應(yīng)參數(shù)的QSAR模型。

圖2 表征劑量效應(yīng)關(guān)系的參數(shù)Fig. 2 The parameters characterizing dose-effect relationships

CompoundAminAmax1Amax2x0-1x0-2h1h2R2SDSCP-154 538.030-149.95-5.11-5.111.011.020.9213.90SMX-1.19E6024.58-3.37-3.371.051.050.8922.29SM-18 472.51-2.44-95.51-4.28-4.282.872.850.9214.41SDX-380.370-185.09-3.36-4.870.700.990.8227.60SMP-637.13-3.66-25.37-2.73-2.880.940.430.9019.22SMR-218.750-75.97-3.98-5.125.140.920.9117.56SMZ-16 448.450-94.90-3.48-3.491.521.500.8526.94SD-282.040-100-3.75-5.283.651.380.9524.23SPY-239.780-100-3.67-5.082.891.010.92 16.22SIZ-254.030-100-5.14-6.363.721.760.9813.06

表3 SAs對(duì)E. coli的生長(zhǎng)效應(yīng)和突變效應(yīng)濃度及效應(yīng)值Table 3 The concentration and effect value of mutation and growth effect of SAs on E. coli

注：EC0為1%時(shí)的最低可觀測(cè)生長(zhǎng)抑制效應(yīng)濃度，EC50為抑制率為50%時(shí)的濃度。

Note： EC0stands for the lowest observable concentration of growth inhibition effect, EC50stands for the concentration when the inhibition rate is 50%.

對(duì)SAs的突變效應(yīng)參數(shù)和物化參數(shù)的皮爾遜相關(guān)性分析表明，E與lgRC0-1或RCS(即lgRC0-2～lgRC0-1)，MP與PA中度相關(guān)(0.8>|r|≥0.5)。建立磺胺的物化參數(shù)對(duì)lgRC0-1、RCS、PA的QSAR模型如式(4)、(5)和(6)所示：

lgRC0-1=-6.652-0.028×E

(4)

n=10,R2=0.482, SE=0.770,F=7.452,P=0.026

RCS=1.821+0.028×E

(5)

n=10,R2=0.483, SE=0.774,F=7.460,P=0.026

PA=728.055-2.301×MP

(6)

n=10,R2=0.456, SE=44.701,F= 6.693,P=0.032

與Pmax中度相關(guān)的參數(shù)包括GAP、DMG。建立磺胺的物化參數(shù)對(duì)Pmax的QSAR模型如式(7)所示：

Pmax=233.203-264.330×GAP-11.257×DMG

(7)

n=10,R2=0.714, SE=16.923,F=8.748,P=0.012

從以上突變效應(yīng)參數(shù)的QSAR模型可以看出，lgRC0-1、RCS和PA的QSAR模型中R2均小于0.5，PA和Pmax的SE大于1，說明這些模型可靠性較差，不適合相關(guān)突變效應(yīng)參數(shù)的預(yù)測(cè)。

值得注意的是，lgRC0-2與Ebinding模型和lgRCmax與Ebinding、DMG模型中R2均大于0.7，SE均小于1，Q2均大于0.7，說明這些模型的預(yù)測(cè)值和測(cè)定值的擬合程度和穩(wěn)定性較好。Ebinding參數(shù)參與的lgRC0-2的QSAR模型如式(8)所示：

lgRC0-2=-7.594-0.082×Ebinding

(8)

lgRCmax與Ebinding和DMG高度相關(guān)，建立QSAR模型如式(9)所示：

lgRCmax=-7.299-0.073×Ebinding-0.110×DMG

(9)

Ebinding用于表征化合物磺胺(SAs)與靶蛋白二氫葉酸合成酶(DHPS)的結(jié)合強(qiáng)弱。從式(8)和(9)可知，Ebinding與lgRC0-2或lgRCmax的相關(guān)性均較好，推測(cè)磺胺分子是對(duì)氨基苯甲酸(PABA)的結(jié)構(gòu)類似物，它能競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合到DHPS上，從而抑制葉酸的合成[15]，而葉酸是合成dNTP的原料，當(dāng)葉酸合成通路受阻后，細(xì)胞中dNTP含量減少，直接影響細(xì)胞的突變率[16]。

2.3 模型評(píng)價(jià)分析

為了更好地檢驗(yàn)lgRC0-2和lgRCmax的QSAR模型的預(yù)測(cè)能力，我們對(duì)10種藥按照“抽出1個(gè)樣本→余下樣本建模→預(yù)測(cè)抽出樣本→放回抽出樣本”的順序?qū)υ瓨颖炯M(jìn)行操作，直到所有樣本均被抽出一次并進(jìn)行預(yù)測(cè)為止[17]。雷達(dá)圖分析法具有簡(jiǎn)單、直觀的特點(diǎn)，故本文通過雷達(dá)圖對(duì)結(jié)果進(jìn)行展示。

圖3 預(yù)測(cè)lgRC0-2值和實(shí)測(cè)lgRC0-2值的雷達(dá)圖Fig. 3 Radar chart of the predicted and experimental values of lgRC0-2

CompoundEbindingGAPMPEDMGSCP-29.170.17271.1326.426.67SMX-25.890.18254.1743.995.50SM-31.820.18267.1025.713.50SDX-39.870.19255.8739.227.78SMP-33.120.16232.19107.128.51SMR-33.520.19237.525.695.04SMZ-39.340.18224.8525.404.99SD-37.690231.3826.035.12SPY-36.340.2237.7726.694.05SIZ-30.310.18263.8448.435.25

2.3.1 驗(yàn)證lgRC0-2模型

繪制4個(gè)同心圓，半徑分別為1、2、3和4，從圓心引出平分同心圓的10條射線表示10種SAs，將表5中“實(shí)測(cè)lgRC0-2和預(yù)測(cè)lgRC0-2”列的數(shù)值分別標(biāo)注在代表各相應(yīng)磺胺類化合物的射線上，連接各標(biāo)注點(diǎn)，形成一個(gè)多邊形，即為預(yù)測(cè)lgRC0-2值和實(shí)測(cè)lgRC0-2值的雷達(dá)圖。

由圖3可知，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值具有很好的相關(guān)性，認(rèn)為模型具有好的內(nèi)部預(yù)測(cè)能力，可用于相關(guān)的突變效應(yīng)參數(shù)預(yù)測(cè)。

2.3.2 驗(yàn)證lgRCmax模型

繪制5個(gè)同心圓，半徑分別為1、2、3、4和5，從圓心引出平分同心圓的10條射線表示10種SAs，將表6中“實(shí)測(cè)lgRCmax和預(yù)測(cè)lgRCmax”列的數(shù)值分別標(biāo)注在代表各相應(yīng)磺胺類化合物的射線上，連接各標(biāo)注點(diǎn)，形成一個(gè)多邊形，即為預(yù)測(cè)lgRCmax值和實(shí)測(cè)lgRCmax值的雷達(dá)圖。

圖4 預(yù)測(cè)lgRCmax值和實(shí)測(cè)lgRCmax值的雷達(dá)圖Fig. 4 Radar chart of the predicted and experimental values of lgRCmax

序號(hào)No.CompoundEbinding實(shí)測(cè)lgRC0-2/(mol·L-1)Experimental value of lgRC0-2/(mol·L-1)預(yù)測(cè)lgRC0-2/(mol·L-1)Predicted value of lgRC0-2/(mol·L-1)1SCP-29.17-5.31-5.162SMX-25.89-5.37-5.543SM-31.82-5.04-4.984SDX-39.87-4.37-4.315SMP-33.12-4.69-4.886SMR-33.52-4.94-4.837SMZ-39.34-4.13-4.438SD-37.69-4.68-4.449SPY-36.34-4.63-4.6210SIZ-30.31-5.10-5.11

表6 lgRCmax的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值Table 6 Experimental and predicted values of lgRCmax

由圖4可知，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值具有很好的相關(guān)性，認(rèn)為模型具有好的內(nèi)部預(yù)測(cè)能力，可用于相關(guān)的突變效應(yīng)參數(shù)預(yù)測(cè)。

綜上可知：

(1) SAs對(duì)E.coli的突變效應(yīng)的研究，可能是由于作用于葉酸合成通路的SAs具有對(duì)E.coli的突變促進(jìn)效應(yīng)，從而影響了E.coli的突變率。

(2) 10種SAs不同效應(yīng)濃度之間關(guān)系為：lgRC0-2≈ lgEC50> lgRCmax> lgEC0> lgRC0-1，通過lgEC0> lgRC0-1可知，E.coli的突變調(diào)控系統(tǒng)更敏感，能夠及時(shí)響應(yīng)環(huán)境脅迫并產(chǎn)生一系列適應(yīng)環(huán)境的行為。

(3) 通過對(duì)SAs的突變效應(yīng)參數(shù)和物化參數(shù)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，找出與突變效應(yīng)參數(shù)相關(guān)性較大的物化參數(shù)，并由此構(gòu)建出每個(gè)突變效應(yīng)參數(shù)的QSAR模型。分析可知，Ebinding與lgRC0-2或lgRCmax具有較好的相關(guān)性，可能由于磺胺類化合物(SAs)會(huì)作用于葉酸合成通路，影響嘌呤、嘧啶堿基的合成，從而對(duì)E.coli的突變具有促進(jìn)效應(yīng)。通過雷達(dá)圖驗(yàn)證，lgRC0-2與Ebinding模型和lgRCmax與Ebinding、DMG模型均具有良好的內(nèi)部預(yù)測(cè)能力，可以用來預(yù)測(cè)突變效應(yīng)與Ebinding之間的關(guān)系。