腈菌唑不同對(duì)映體對(duì)麗斑麻蜥性腺系統(tǒng)的影響

朱飛龍，郝偉玉，尹晶，常靜，李濟(jì)彤，李建中，李偉，王會(huì)利,*

1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

三唑類是一種廣譜的殺菌劑，能夠保護(hù)農(nóng)作物或蔬菜免受真菌感染[1]。三唑類殺菌劑的抗菌機(jī)理是通過抑制羊毛甾醇-14α-去甲基化酶(CYP51)來限制真菌麥角甾醇的生物合成，從而對(duì)真菌的細(xì)胞壁造成干擾[2]。然而，三唑類殺菌劑的大量使用可能破壞陸地生態(tài)系統(tǒng)平衡從而影響當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境。

三唑類殺菌劑大多都有手性，它們有1個(gè)或2個(gè)手性中心，擁有多個(gè)對(duì)映體[3]。環(huán)境中的手性物質(zhì)一旦進(jìn)入生物體內(nèi)，其不同對(duì)映體在生物體內(nèi)的活性和代謝經(jīng)常具有對(duì)映選擇性，這就導(dǎo)致不同對(duì)映體對(duì)生物體的毒性、致癌性、致突變性以及內(nèi)分泌干擾都有一定的對(duì)應(yīng)選擇性[4]。一些研究也發(fā)現(xiàn)三唑類殺菌劑在不同生物體內(nèi)的代謝和毒性也具有特異的對(duì)映選擇性[5-8]。腈菌唑是一種常見的三唑類殺菌劑，它有2個(gè)對(duì)映體，對(duì)鳥類的急性毒性LD50為498(408～598, 95% C.I.) mg·kg-1，被歸類為中等有毒物。盡管腈菌唑的急性毒性較低，但是腈菌唑大量使用所造成的環(huán)境和健康問題不容忽視。研究發(fā)現(xiàn)，腈菌唑暴露能對(duì)雌性嚙齒動(dòng)物的生殖發(fā)育產(chǎn)生不利影響[9]，也能對(duì)嚙齒動(dòng)物的肝臟造成不同程度的損傷并擾亂其體內(nèi)類固醇激素的平衡[10]。研究人員還發(fā)現(xiàn)，腈菌唑既能與雌激素受體(ER-α)結(jié)合，又能與雄激素受體(AR)相結(jié)合[11-12]。從這些研究我們發(fā)現(xiàn)腈菌唑暴露可能會(huì)干擾生物體性腺系統(tǒng)的正常生理功能。然而，這些研究只關(guān)注于內(nèi)消旋狀態(tài)的腈菌唑，忽視了腈菌唑不同單體對(duì)生物體的影響。因此，有必要從對(duì)映體的層面對(duì)腈菌唑的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)有一個(gè)準(zhǔn)確完整的評(píng)價(jià)。

目前，爬行動(dòng)物(包括蜥蜴)在世界范圍內(nèi)遞減，其中一個(gè)重要原因就是內(nèi)分泌干擾農(nóng)藥所引起的爬行動(dòng)物的繁殖率下降[13-14]。相比魚類、鳥類、昆蟲和哺乳動(dòng)物，目前對(duì)爬行動(dòng)物的生態(tài)毒理學(xué)研究仍然是最受關(guān)注的。而與其他爬行動(dòng)物(鱷魚或海龜)不同，蜥蜴體型小，對(duì)環(huán)境變化敏感，易于在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)[15]。近年來，許多研究都使用蜥蜴來研究爬行動(dòng)物毒理學(xué)[15-16]。但是，因不同國(guó)家和地區(qū)在生物區(qū)系、自然環(huán)境等方面差異較大，本土物種與通用種對(duì)同種化學(xué)品的敏感性可能存在差異[17]。因此，為使研究結(jié)果能反映當(dāng)?shù)貙?shí)情，應(yīng)選用當(dāng)?shù)乇就硫狎嫖锓N進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)評(píng)價(jià)。麗斑麻蜥(Eremiasargus)是中國(guó)的本土蜥蜴，廣泛分布于長(zhǎng)江以北。目前，我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了麗斑麻蜥的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并對(duì)其生物學(xué)背景進(jìn)行了初步的研究。因此，在本研究中，麗斑麻蜥被選為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來替代爬行動(dòng)物進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)研究。

為了探究腈菌唑?qū)τ丑w對(duì)蜥蜴性腺內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響，受試蜥蜴分別暴露于腈菌唑的2種對(duì)映體，對(duì)蜥蜴血液中性激素水平和性腺中類固醇合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化進(jìn)行記錄。本研究探討了腈菌唑?qū)τ丑w對(duì)蜥蜴性腺系統(tǒng)的內(nèi)分泌干擾機(jī)制，為三唑類手性農(nóng)藥對(duì)蜥蜴或其他爬行動(dòng)物的毒理學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 化學(xué)品和試劑

分析純的腈菌唑消旋體(純度>99.0%)從農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)化學(xué)品控制研究所(北京)獲得。所有其他液體試劑均購(gòu)自化學(xué)試劑有限公司(北京)。單體分離前，外消旋的腈菌唑儲(chǔ)存在乙腈(分析純)中，4 ℃避光保存。

1.2 腈菌唑單體分離

在Agilent 1260高效液相色譜(HPLC)上使用手性柱(CHIRALCEL OD-3R)分離(+)-腈菌唑(MT1)和(-)-腈菌唑(MT2)。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，流動(dòng)相為乙腈和純水(40:60，V/V)的混合物，流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL。分離得到的2種對(duì)映異構(gòu)體的純度均>97%。分離后，將MT1和MT2溶于乙醇中，然后用玉米油(V乙醇∶V玉米油=1:9)稀釋?；旌弦涸? ℃中遮光貯存，暴露實(shí)驗(yàn)前先平衡至室溫，然后混合均勻使用。

1.3 蜥蜴飼養(yǎng)

成年(約2～3年)的雄性和雌性蜥蜴來自本研究團(tuán)隊(duì)的蜥蜴繁殖實(shí)驗(yàn)室(北京昌平區(qū))。在暴露實(shí)驗(yàn)中使用體重(3.5～4.5 g)和長(zhǎng)度(50～60 mm)相似的蜥蜴。蜥蜴放置在一個(gè)5 m×1.2 m×0.4 m的室內(nèi)玻璃箱中，底部覆蓋有10 cm厚的細(xì)砂土。在玻璃箱中，放置一些水碟、遮蔽物和樹枝，箱內(nèi)控制溫度(26～30 ℃)和濕度(30%～50%)以及足夠的光照(光暗比為12 h:12 h)以保持蜥蜴健康的日常生活。另外，蜥蜴每天喂食2次活的黃粉蟲(Tenebriomolitor)，并且每2天清除一次它們的排泄物。

1.4 劑量選擇和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

目前，環(huán)境污染物對(duì)爬行動(dòng)物的毒性測(cè)試還沒有建立標(biāo)準(zhǔn)方法[18]，爬行動(dòng)物的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估通常用鳥類來替代[19]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)75 mg·kg-1的腈菌唑暴露后，大鼠肝臟的重量和組織病理學(xué)受到嚴(yán)重影響[20]。而在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，50 mg·kg-1的腈菌唑暴露對(duì)蜥蜴體重造成顯著影響，但未觀察到蜥蜴死亡。因此，選擇腈菌唑?qū)B類急性毒性LD50的大約10%(50 mg·kg-1)作為蜥蜴的暴露濃度。

在實(shí)驗(yàn)之前，將蜥蜴按性別比例(1:1)分組，并且飼養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)玻璃箱(30 cm×30 cm×20 cm)中。飼養(yǎng)條件與1.3中提到的相同。所有蜥蜴(n=72)分為3組(每組n=24)，包括一個(gè)對(duì)照組和2個(gè)試驗(yàn)組。2個(gè)試驗(yàn)組中的蜥蜴根據(jù)體重分別經(jīng)口暴露50 mg·kg-1的MT1和MT2，對(duì)照組僅施用溶劑(玉米油+乙醇)暴露，每周暴露2次。在第1、7、14和28天每組各取出6只蜥蜴(雌雄比=1∶1)處死，立即收集蜥蜴血液，并將其肝臟和性腺(睪丸或卵巢)冷凍于-20 ℃，留待進(jìn)一步分析。

1.5 性激素(雌二醇和睪酮)的測(cè)量

收集的血液立即在4 ℃下以5 000×g離心10 min，并將分離的血清儲(chǔ)存于-80 ℃以便進(jìn)行性激素的測(cè)量。嚴(yán)格按照生產(chǎn)商的說明書，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)檢測(cè)血清中雌二醇(E2)和睪酮(T)的濃度。測(cè)量批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于15%，試劑盒測(cè)定的靈敏度T為0.05 ng·mL-1，E2為25 pg·mL-1。為方便分析，所有激素的濃度均表示為相對(duì)于對(duì)照組激素濃度的倍數(shù)。

1.6 RNA分離和cDNA合成

使用TrizolA+試劑(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)從雌雄蜥蜴的肝和性腺中提取總RNA。然后，使用Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)測(cè)量總RNA的濃度和OD260/OD280的比率，用于隨后的cDNA克隆。

嚴(yán)格按照FastKing RT試劑盒(含gDNase)(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)的說明書反轉(zhuǎn)錄大約2 μg的總RNA。首先，加入總RNA和2 μL 5×gDNA Buffer，接下來加入RNase-Free ddH2O使其體積補(bǔ)足10 μL，在42 ℃溫育3 min，然后在冰上冷卻。加入含有2 μL 10×King RT Buffer, 1 μL FastKing RT Enzyme Mix, 2 μL FQ-RT Primer Mix和5 μL RNase-Free ddH2O的混合液至最終體積為20 μL。在42 ℃溫育15 min，95 ℃加熱3 min使逆轉(zhuǎn)錄失活，反應(yīng)結(jié)束。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR

使用Talent qPCR PreMix(SYBR Green)(購(gòu)自北京天根生化科技有限公司)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，實(shí)時(shí)定量?jī)x的型號(hào)為MX3005P(Stratagene, USA)，反應(yīng)總體積為20 μL。反應(yīng)包括擴(kuò)增階段和解離階段。擴(kuò)增階段程序?yàn)椋?5 ℃、3 min，接下來是95 ℃、5 s和60 ℃、32 s并循環(huán)40次。解離階段程序?yàn)椋?5 ℃、40 s，60 ℃、40 s和95 ℃、40 s。本研究中選擇的類固醇合成相關(guān)基因及其引物分別列于表1。β-Actin和17β-HSD基因的引物序列參考之前的研究[3]，其他引物由作者使用Primmer Primmer 5.0軟件(Canada)設(shè)計(jì)。在這項(xiàng)研究中，使用管家基因β-Actin來標(biāo)定mRNA的表達(dá)。基因的特異性擴(kuò)增通過熔解曲線(僅一個(gè)峰)來分析確認(rèn)。所有樣品均重復(fù)測(cè)試3次，使用△△Ct方法進(jìn)行結(jié)果分析。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均通過SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，并使用Levene's檢驗(yàn)數(shù)據(jù)方差的均一性。采用ANOVA方法分析對(duì)照組與暴露組之間差異。*P<0.05、**P<0.01表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 蜥蜴體重變化

實(shí)驗(yàn)期間，記錄對(duì)照組和暴露組蜥蜴在取樣點(diǎn)1、7、14和28 d的體重變化(見表2)。與對(duì)照組相比，MT2暴露組蜥蜴在所有采樣點(diǎn)的體重均無明顯變化。然而，MT1暴露組的蜥蜴體重在28 d時(shí)出現(xiàn)顯著下降，在其他時(shí)間點(diǎn)沒有觀察到顯著變化。此外，實(shí)驗(yàn)期間蜥蜴沒有出現(xiàn)中毒癥狀或死亡。

2.2 血液性激素水平

MT1和MT2暴露對(duì)血液中的性激素水平(T和E2)有著顯著影響。MT1暴露導(dǎo)致雄性蜥蜴血液內(nèi)T濃度在1、14和28 d顯著上升(4.41、3.62和6.28倍)(圖1A)。而在雌性蜥蜴血液內(nèi)，T濃度在14 d時(shí)顯著下降(-4.76倍)，28 d時(shí)升高(1.70倍)。MT1暴露也導(dǎo)致雄性蜥蜴血液內(nèi)的E2濃度在1 d時(shí)降低(-5.88倍)，而在28 d時(shí)升高(2.54倍)。而雌性蜥蜴血液中的E2水平在1 d時(shí)顯著增加(1.58倍)，在14 d出現(xiàn)下降(-1.99倍)。

MT2暴露也引起雄性蜥蜴血液內(nèi)T濃度在1、14和28 d出現(xiàn)顯著上升(2.10、6.95和2.50倍)(圖1B)。而在雌性蜥蜴血液中，T的濃度在7 d(1.37倍)和28 d(3.56倍)顯著增加，在14 d(-2.18倍)下降。MT2暴露也導(dǎo)致雄性蜥蜴血液中的E2水平在1 d(1.87倍)和28 d(1.33倍)明顯上升，而在7 d(-1.33倍)出現(xiàn)下調(diào)。而雌性蜥蜴血液中E2水平在14 d顯著降低(-1.97倍)，在28 d時(shí)顯著上升(1.52倍)。

表1 定量PCR中基因表達(dá)所需引物序列Table 1 Primers used for quantitative PCR measurement of gene expression

表2 腈菌唑暴露期間蜥蜴體重的變化Table 2 Changes in body weight of Eremias argus during myclobutanil (MT) exposure

注：數(shù)據(jù)以平均值±方差的形式表示；*表示與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05)；MT1表示(+)-腈菌唑，MT2表示(-)-腈菌唑。

Note： The data were expressed as mean±S.E.; asterisks indicate significant difference compared to the control (*P< 0.05); MT1 and MT2 are two enantiomers; MT1 stands for (+)- myclobutanil, and MT2 stands for (-)- myclobutanil.

圖1 MT1(A)和MT2(B)暴露后麗斑麻蜥血液中睪酮(T)和雌二醇(E2)濃度隨時(shí)間的變化注：相對(duì)于對(duì)照組，* P<0.05、** P<0.01。Fig. 1 Time-dependent effects of (A) MT1 and (B) MT2 on concentrations of testosterone (T) and estradiol (E2) in blood of Eremias argusNote: *P<0.05, **P<0.01, relative to control.

2.3 性腺相關(guān)基因表達(dá)

MT1暴露導(dǎo)致蜥蜴性腺相關(guān)基因的表達(dá)隨著暴露時(shí)間而發(fā)生改變(圖2)。在肝臟中，雌性和雄性蜥蜴的ER-α和AR基因表達(dá)在1 d和7 d均下調(diào)，并于14 d和28 d上調(diào)。在性腺中，MT1暴露后基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)也發(fā)生了改變。暴露1 d后，雌性蜥蜴卵巢中17β-HSD和CYP11A基因表達(dá)顯著下調(diào)，而ER-α、CYP17和CYP19A基因表達(dá)上調(diào)。暴露7 d后，蜥蜴卵巢中除了3β-HSD和CYP11A顯著下調(diào)之外，其他性腺相關(guān)基因表達(dá)均顯著上調(diào)。暴露14 d后，ER-α、AR和CYP11A基因表達(dá)在卵巢中顯著下調(diào)，而3β-HSD基因表達(dá)則顯著上調(diào)。暴露28 d后，ER-α和3β-HSD基因表達(dá)在卵巢中顯著下調(diào)，而AR、CYP11A、CYP17和CYP19A基因表達(dá)顯著上調(diào)。與卵巢相比，MT1對(duì)睪丸中性腺相關(guān)基因的表達(dá)影響不同。暴露1 d后，睪丸中只有17β-HSD基因表達(dá)沒有變化，其他基因表達(dá)均顯著上調(diào)。暴露7 d后，睪丸中ER-α、AR和CYP17基因表達(dá)顯著下調(diào)，而CYP19A基因表達(dá)顯著上調(diào)。暴露14 d后，睪丸中AR、3β-HSD、CYP11A和CYP19A基因表達(dá)顯著上調(diào)。暴露28 d后，睪丸中ER-α基因表達(dá)顯著下調(diào)，而CYP17和CYP19A基因表達(dá)顯著上調(diào)。

MT2暴露同樣導(dǎo)致蜥蜴性腺相關(guān)基因的表達(dá)隨著暴露時(shí)間而發(fā)生改變(圖3)。在暴露1 d后，雌性蜥蜴肝臟中ER-α基因表達(dá)顯著上調(diào)，而雄性蜥蜴肝臟中ER-α和AR基因表達(dá)顯著下調(diào)。在暴露7 d和28 d后，雌性蜥蜴肝臟中ER-α基因表達(dá)顯著下調(diào)，而雄性蜥蜴肝臟中ER-α和AR基因表達(dá)顯著上調(diào)。暴露14 d后，觀察到AR基因的表達(dá)在雌性和雄性蜥蜴的肝臟中均顯著下調(diào)。在蜥蜴卵巢中，暴露1 d后，ER-α和3β-HSD基因表達(dá)顯著上調(diào)，而AR、17β-HSD、CYP11A、CYP17和CYP19A基因的表達(dá)顯著下調(diào)。暴露7 d后，蜥蜴卵巢中CYP11A基因表達(dá)顯著下調(diào)，而ER-α、AR、3β-HSD、CYP17和CYP19A基因表達(dá)顯著上調(diào)。暴露14 d后，卵巢中ER-α表達(dá)下調(diào)，3β-HSD和CYP19A表達(dá)上調(diào)。暴露28 d后，蜥蜴卵巢中僅17β-HSD基因表達(dá)未發(fā)生改變，其他基因表達(dá)均顯著上調(diào)。與卵巢相比，MT2對(duì)睪丸中性腺相關(guān)基因的表達(dá)影響不太明顯。暴露1 d后，只有CYP17和CYP19A基因表達(dá)顯著上調(diào)，而其他基因在睪丸中表達(dá)未發(fā)生改變。暴露7 d后，睪丸中ER-α、AR、3β-HSD、CYP11A和CYP17基因表達(dá)顯著下調(diào)，而CYP19A的表達(dá)顯著上調(diào)。暴露14 d后，AR、CYP11A和CYP17基因表達(dá)在睪丸中顯著上調(diào)。暴露28 d后，觀察到蜥蜴睪丸中ER-α、3β-HSD、CYP11A和CYP17基因表達(dá)顯著上調(diào)。

3 討論(Discussion)

3.1 MT1和MT2對(duì)蜥蜴體重的影響

體重的變化是評(píng)價(jià)蜥蜴成長(zhǎng)的重要指標(biāo)[21]。在本研究中，觀察到MT2暴露組蜥蜴在所有采樣點(diǎn)的體重均無明顯變化，而MT1暴露組的蜥蜴體重在28 d時(shí)出現(xiàn)顯著下降。體重的減輕可能會(huì)影響蜥蜴的正常發(fā)育和繁殖。因此，與MT2相比，MT1暴露會(huì)影響蜥蜴的健康成長(zhǎng)。

圖2 MT1暴露組中雌雄麗斑麻蜥類固醇合成相關(guān)基因表達(dá)隨時(shí)間的變化注：基因表達(dá)數(shù)據(jù)以與對(duì)照組相比的倍數(shù)來表示。Fig. 2 Time-dependent effects of MT1 on the expression of steroidogenic-related genes in female and male Eremias argusNote: Gene expression is expressed as the fold change compared to the corresponding vehicle controls.

圖3 MT2暴露組中雌雄麗斑麻蜥類固醇合成相關(guān)基因表達(dá)隨時(shí)間的變化注：基因表達(dá)數(shù)據(jù)以與對(duì)照組相比的倍數(shù)來表示。Fig. 3 Time-dependent effects of MT2 on the expression of steroidogenic-related genes in female and male Eremias argusNote: Gene expression is expressed as the fold change compared to the corresponding vehicle controls.

3.2 MT1和MT2對(duì)性激素水平的影響

性類固醇激素(包括T和E2)在性腺中合成并參與調(diào)節(jié)生物體的一系列過程，如性腺發(fā)育、性別分化和性功能維持等[22]。在脊椎動(dòng)物中，T和E2通常處于動(dòng)態(tài)平衡中，并作用于激活雌雄激素受體[3]。一旦動(dòng)態(tài)平衡被打破，性腺的正常生理和生殖功能將受到影響。因此，T和E2水平的變化是評(píng)估MT1和MT2對(duì)蜥蜴性腺影響的有力指標(biāo)。

在本研究中，與法倔唑暴露后雄性黑頭呆魚(fathead minnows)血漿中T濃度出現(xiàn)上升類似[23]，MT1暴露后也檢測(cè)到雄性蜥蜴血液中的T水平上升(見圖1A)。而在MT1暴露后，雌性蜥蜴血液中的E2濃度在14 d時(shí)顯著降低，然后又在28 d時(shí)回到正常水平(與對(duì)照相比)。類似地，酮康唑暴露在短期(≤8 d)內(nèi)使雌性黑頭呆魚血漿中的E2水平降低，但在暴露21 d后，E2水平也恢復(fù)至正常水平，這似乎是由于不同的補(bǔ)償機(jī)制相互作用的結(jié)果[24-25]。E2和T的濃度變化通常伴隨著一系列的生殖損傷。三唑酮暴露使雄性大鼠在出生后50 d血清睪酮增加，并損害了雄性大鼠的受精和生育能力[1]。在500和1 000 μg·L-1的丙環(huán)唑暴露下，雌性黑頭呆魚體內(nèi)的E2濃度和產(chǎn)蛋量均出現(xiàn)下降[26]。MT2的暴露也改變了蜥蜴血液中T和E2的水平。與MT1暴露結(jié)果類似，MT2暴露也增加了雄性蜥蜴血液中的T水平(參見圖1B)。與MT1暴露結(jié)果相反，MT2暴露后雌性蜥蜴血液中E2水平在1 d無明顯變化，但在28 d出現(xiàn)明顯增加。一般來說，手性對(duì)映體是有選擇性的，其對(duì)生物體的影響可能完全不同[27]。在雄性蜥蜴暴露1 d后，也發(fā)現(xiàn)了這種對(duì)映選擇性：MT1暴露降低了血液中的E2水平，而MT2暴露則使血液中的E2水平升高。之前研究發(fā)現(xiàn)手性農(nóng)藥暴露對(duì)水生生物毒性也有類似的對(duì)映選擇效應(yīng)[4,28-29]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，MT1和MT2對(duì)蜥蜴血液中的E2是有對(duì)映選擇性的，兩者均可以改變蜥蜴體內(nèi)性激素平衡，這會(huì)干擾蜥蜴性腺系統(tǒng)的正常生理功能。

3.3 MT1和MT2對(duì)性激素合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

CYP酶(如CYP11A、CYP17和CYP19A等)對(duì)生物體內(nèi)睪酮(T)和雌二醇(E2)的合成至關(guān)重要[1]。之前的研究發(fā)現(xiàn)，咪鮮胺和酮康唑都可以影響CYP11A和CYP17基因的表達(dá)，而這2個(gè)基因則是合成T的上游基因[26]。在體外實(shí)驗(yàn)也觀測(cè)到：經(jīng)丙環(huán)唑和三唑酮處理后，芳香化酶(CYP19A)的活性受到抑制[30]。芳香化酶(CYP19A)是將睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇的限速酶[31]。因此，一旦芳香化酶受到抑制，生物體內(nèi)E2的濃度會(huì)趨于下降。與許多三唑類殺真菌劑類似，暴露于腈菌唑改變了大鼠睪丸中各種CYP酶(如CYP11A、CYP17和CYP19A等)的表達(dá)和大鼠血液中性激素的水平，導(dǎo)致了大鼠不同程度的生殖損傷[20]。在本研究中，在MT1和MT2暴露后發(fā)現(xiàn)性激素合成相關(guān)基因的表達(dá)也發(fā)生了改變(參見圖2、圖3)。此外，同一基因的表達(dá)在MT1和MT2暴露后能觀察到明顯的對(duì)映選擇差異和雌雄蜥蜴間的性別差異。MT1和MT2暴露對(duì)性激素水平產(chǎn)生影響，相應(yīng)地能激發(fā)性腺相關(guān)基因做出對(duì)應(yīng)的補(bǔ)償機(jī)制。例如，雌性蜥蜴在MT2暴露的14 d，CYP19A基因表達(dá)的上調(diào)明顯補(bǔ)償了血液中E2水平的降低。之前對(duì)法倔唑的研究也證實(shí)了在日本青鳉(Japanese medaka)的卵巢中性腺相關(guān)基因表達(dá)與E2產(chǎn)量之間的補(bǔ)償關(guān)系[32]。在類固醇合成抑制劑暴露后，雄性個(gè)體中也能觀察到性腺基因表達(dá)與激素間的類似補(bǔ)償機(jī)制。例如，在酮康唑暴露后的雄魚體內(nèi)T水平的變化不大，這可能大部分歸因于CYP11A和CYP17基因表達(dá)的上調(diào)[25]。在MT2暴露7 d后，觀測(cè)到雄性蜥蜴血液T濃度增加，伴隨著睪丸中3β-HSD、CYP11A和CYP17基因表達(dá)的下調(diào)。3β-HSD、CYP11A和CYP17基因能夠編碼一系列用于合成T的酶，因此，如果這些基因的表達(dá)下調(diào)，T的濃度最終會(huì)趨于下降。性腺相關(guān)基因?qū)π约に氐恼{(diào)控在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中表現(xiàn)明顯。例如，在MT1暴露14 d后，蜥蜴卵巢中CYP11A和CYP17的基因表達(dá)下調(diào)，而CYP19A基因的表達(dá)不變，這一結(jié)果剛好解釋了雌性蜥蜴血液中E2和T水平的下降。而在MT2暴露的28 d，蜥蜴睪丸中CYP11A和CYP17基因表達(dá)的上調(diào)以及CYP19A基因表達(dá)的不變也解釋了雄性蜥蜴血液中E2和T水平的增加。類似地，在法倔唑暴露7 d后，CYP11B(能將睪酮轉(zhuǎn)化為11-酮睪酮)和膽固醇轉(zhuǎn)移蛋白(StAR)的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，同時(shí)也觀測(cè)到了魚血漿11-酮睪酮的增加[32]。

在脊椎動(dòng)物中，性激素受體(如ER-α和AR)在其生殖過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[3]。類固醇激素(如E2和T)只能通過它們的受體起作用，這些受體直接或間接調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)。因此，性激素水平的變化也影響著ER-α和AR基因的表達(dá)。例如，在MT1暴露14 d時(shí)，雌性蜥蜴血液中E2濃度降低，而此時(shí)雌性蜥蜴肝臟中ER-α基因的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的上調(diào)。這是由于隨著E2濃度減少，ER-α基因只有上調(diào)表達(dá)量才能更多地與E2結(jié)合。與之類似，在MT1暴露1 d時(shí)，雄性蜥蜴血液中T濃度上升，而此時(shí)雄性蜥蜴肝臟中AR基因的表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)。此外，MT1和MT2暴露后，ER-α和AR這2個(gè)基因在蜥蜴肝臟和在蜥蜴性腺中的表達(dá)有明顯的組織差異(參見圖2和圖3)。綜上，MT1和MT2暴露能對(duì)蜥蜴的雌雄激素受體產(chǎn)生一定影響，進(jìn)而可能危及蜥蜴的正常生殖。

致謝：感謝中科院生態(tài)環(huán)境研究中心郭寶元副研究員對(duì)實(shí)驗(yàn)和文章的指導(dǎo)。