室內(nèi)糞土模型中土霉素對(duì)主要反硝化基因轉(zhuǎn)錄水平和菌群結(jié)構(gòu)特征的影響

林曼霞，鄒勇，孫永學(xué)

國(guó)家獸藥安全評(píng)價(jià)(環(huán)境評(píng)估)實(shí)驗(yàn)室(華南農(nóng)大)，國(guó)家獸醫(yī)微生物耐藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，廣東省獸藥研制與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642

在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中大量的抗生素用于預(yù)防和治療動(dòng)物疾病，其中，土霉素(oxytetracycline, OTC)作為大量獸用抗生素中四環(huán)素類(lèi)使用最廣泛的一種[1],是一種廣譜抗菌藥，被廣泛應(yīng)用于豬、家禽等動(dòng)物的疾病預(yù)防和感染，且由于其廣譜抗菌活性及費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)常被作為畜禽的抗菌促生長(zhǎng)劑[2-3]。但是，土霉素進(jìn)入畜禽體后,大部分藥物無(wú)法被吸收，以原形及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物隨糞尿等排泄物進(jìn)入環(huán)境,其中主要一部分作為肥料施加于土壤中，導(dǎo)致土壤中抗生素的長(zhǎng)期積累，給環(huán)境帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)[4-6]。

國(guó)內(nèi)有學(xué)者研究了溫度、水分、pH值、施肥等因素對(duì)土壤反硝化的影響[8-12]，而關(guān)于含有抗生素的糞便施加于土壤中對(duì)反硝化作用影響的研究仍然較少。故本試驗(yàn)構(gòu)建室內(nèi)抗生素-糞便-土壤模型，通過(guò)添加不同濃度的土霉素，并結(jié)合運(yùn)用熒光定量PCR和限制性末端片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)技術(shù)研究反硝化中微生物的響應(yīng)特征，揭示不同濃度土霉素存在條件下，土壤反硝化作用以及土壤微生物之間的關(guān)系，以期為減少農(nóng)田菜地氮素流失等氮肥管理提供科學(xué)依據(jù)，并為開(kāi)展系統(tǒng)的生態(tài)毒理學(xué)研究與科學(xué)評(píng)估做基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 土壤、雞糞采集及處理

供試菜地土采自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地土(東經(jīng)113°21’6″，北緯23°9’53″)，取樣深度為0～20 cm。土壤運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，過(guò)2.0 mm 篩后避光于20 ℃條件下靜置7 d，測(cè)得pH值為5.77，全碳含量為77.0 mg·kg-1，全氮占0.066%，全磷占0.027%，銨態(tài)氮為2.23 mg·kg-1，硝態(tài)氮為9.24 mg·kg-1，土壤類(lèi)型為砂質(zhì)粘壤土。雞糞采集自飼喂無(wú)任何抗生素的SPF雞，陰干，過(guò)2.0 mm篩于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 構(gòu)建室內(nèi)抗生素-糞便-土壤模型

設(shè)置空白組，低、中、高濃度土霉素添加組共4組，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。每千克土壤中加入20 g雞糞，土霉素低、中、高濃度分別為20 μg·kg-1、200 μg·kg-1、2 000 μg·kg-1土壤。噴灑純水至最大持水率的50%并攪拌均勻，分裝于43 cm×18 cm×13 cm的塑料盆中，每盆4 kg，在室溫20 ℃下，12 h光照下培養(yǎng)。在第1、7、14、30、60天采集土壤樣品放置-20 ℃保存。

1.3 土壤總DNA提取

取1 g土壤樣品，按照土壤DNA提取試劑盒(OMEGA)說(shuō)明書(shū)提取土壤總DNA，DNA的濃度和質(zhì)量用核酸蛋白儀(NanoDrop, USA)進(jìn)行測(cè)量，于-20 ℃保存。

1.4 熒光定量PCR

功能基因的定量分析采用SYBR GREEN法，檢測(cè)硝酸鹽還原酶基因narG,亞硝酸鹽還原酶基因nirS、nirK，一氧化氮還原酶基因nosZ的絕對(duì)定量。20 μL的q-PCR反應(yīng)體系，包括SYBR Premix Ex Taq II(10 μL)、dd H2O(7.4 μL)、上下游引物(各0.8 μL)和DNA模板(1 μL)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在Roche LightCycler96進(jìn)行反應(yīng)。定量引物和擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。

1.5 末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)分析

提取土壤總DNA按照上述熒光定量的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，nirS基因擴(kuò)增產(chǎn)物使用內(nèi)切酶HaeⅠ(TaKaRa)酶切,nosZ基因使用內(nèi)切酶HaeⅢ(TaKaRa)酶切，酶切體系(20 μL)包含：PCR產(chǎn)物15 μL，HaeⅠ或HaeⅢ 1 μL，10×Bufffer 2 μL，ddH2O 2 μL。于37 ℃恒溫箱中反應(yīng)3 h,然后將酶切產(chǎn)物送往上海生工純化、電泳以及測(cè)序。T-RFLP圖譜分析使用GeneMapper (Applied Biosystems)軟件進(jìn)行分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品ROX-500的檢測(cè)范圍，選取大于50 bp,小于500 bp片段，計(jì)算每個(gè)檢測(cè)峰的峰高所占檢測(cè)峰總數(shù)的百分比，剔除小于1%的值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中的數(shù)據(jù)作圖分析在Origin 8中完成，統(tǒng)計(jì)分析在SPSS 19.0軟件中進(jìn)行，其中，對(duì)T-RFLP的結(jié)果采用主成分分析(Principal Component Analysis， PCA)來(lái)研究樣品間群落組成的差異。

圖1 土霉素(OTC)暴露下nirS、nirK、narG和nosZ反硝化基因豐度Fig. 1 Abundance of nirS, nirK, narG and nosZ denitrification genes after exposure to oxytetracycline (OTC)

基因Gene引物Primer序列Sequence片段長(zhǎng)/bpFragment length/bp反應(yīng)條件ConditionnirSnirS cd3aFF-GTSAACGTSAAGGARACSGGnirS R3cd[13]R-GASTTCGGRTGSGTCTTGA42095 ℃/30 s; 95 ℃/15 s, 58 ℃/30 s, 72 ℃/45 s nirKnirK FlaCuF-ATCATGGT(C/G)CTGCCGCGnirK R3Cu[13]R-GCCTCGATCAG(A/G)TTGTGGTT47295 ℃/30 s; 95 ℃/15 s, 57 ℃/60 s, 73 ℃/60 snosZnosZ Z-FF-CGYTGTTCMTCGACAGCCAGnosZ Z1622-R[13]R-CGCRASGGCAASAAGGTSCG72095 ℃/30 s; 95 ℃/30 s, 60 ℃/60 s, 72 ℃/60 snarGnarG FF-TAYGTSGGGCAGGARAAACTGnarG R[14]R-CGTAGAAGAAGCTGGTGCTGT11095 ℃/30 s; 95 ℃/15 s, 55 ℃/30 s, 72 ℃/30 s

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 不同濃度土霉素對(duì)反硝化功能基因豐度變化影響

從圖1(A)中可以看出，空白組nirS基因豐度隨著時(shí)間的推移而逐漸下降，且在相同時(shí)間不同濃度處理時(shí)高濃度組與其他濃度組在第1、14天呈顯著性差異(P<0.05)，說(shuō)明第1天較高濃度的土霉素對(duì)土壤中攜帶nirS基因菌群能產(chǎn)生抑制作用，而到第14天時(shí)高濃度組nirS基因豐度有所上升。而在相同濃度不同時(shí)間情況下，第1天空白組與其他時(shí)間組呈顯著性差異(P<0.05)，其他不同濃度組差異不顯著。低、中濃度土霉素對(duì)nirS基因豐度有促進(jìn)作用，而高濃度有抑制作用。

圖1(B)中在相同時(shí)間不同濃度處理中第7天的空白組與低、中濃度組以及第30天的空白組與其他組差異顯著(P<0.05)，而在相同濃度不同時(shí)間下，各濃度在第1和第7天的差異顯著(P<0.01)，且nirK基因豐度呈先上升后下降的趨勢(shì)。其中低、中濃度仍然對(duì)nirK基因豐度有促進(jìn)作用，基因豐度基本在空白組之上，高濃度則基本上呈抑制作用。

圖1(C)相同時(shí)間不同濃度處理中，空白組與其他組在第1天narG基因豐度差異顯著(P<0.01)，其中，低、中、高濃度對(duì)攜帶narG基因的微生物均有抑制作用且高濃度抑制作用最明顯。其次，高濃度在第14天與其他組差異也顯著(P<0.01)，高濃度在第14天narG基因豐度高于其他各組。而在相同濃度不同時(shí)間下，空白組在第1天和第30、60天差異顯著(P<0.01)，說(shuō)明攜帶narG基因菌群隨時(shí)間的增長(zhǎng)而變化明顯，而最后到第60天時(shí)，各組基因豐度基本達(dá)到一致的平衡水平。

圖2 不同濃度土霉素處理下的nirS型反硝化細(xì)菌的T-RFs相對(duì)百分比和細(xì)菌群落的主成分分析Fig. 2 Relative percentage of T-RFs and principal component analysis of nirS-type denitrifying bacteria at different concentrations of oxytetracycline

圖1(D)顯示相同時(shí)間不同濃度處理中，低濃度組與其他組在第7天nosZ基因豐度差異顯著(P<0.01)，低濃度組nosZ基因豐度在第7天增長(zhǎng)明顯，之后又下降到低于空白組。相同濃度不同時(shí)間下，低濃度第7、60天與其他時(shí)間組的nosZ基因豐度差異顯著(P<0.05)，而其他濃度組第60天與第30天差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明nosZ基因?qū)Φ蜐舛鹊耐撩顾胤磻?yīng)較為敏感。而中、高濃度基本呈抑制趨勢(shì)，但是各濃度組在第30～60天卻都呈上升趨勢(shì)。

綜合以上分析，nirS、nirK兩個(gè)基因豐度中各濃度的變化規(guī)律除了第一天之外基本一致，而narG和nosZ反硝化基因豐度變化卻和上述兩種不同。

2.2 不同濃度土霉素對(duì)土壤中反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)變化影響

本實(shí)驗(yàn)對(duì)nirS、nosZ基因的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，T-RFLP分析結(jié)果顯示，限制性?xún)?nèi)切酶HaeⅠ獲得21個(gè)nirS基因片段(>1%)，分別為53 bp、57 bp、60 bp、62 bp、75 bp、76 bp、77 bp、78 bp、79 bp、87 bp、114 bp、115 bp、116 bp、117 bp、133 bp、136 bp、137 bp、138 bp、210 bp、225 bp、259 bp T-RFs(圖2(A))。

圖3 不同濃度土霉素處理下的nosZ型反硝化細(xì)菌的T-RFs相對(duì)百分比和細(xì)菌群落的主成分分析Fig. 3 Relative percentage of T-RFs and principal component analysis of nosZ-type denitrifying bacteria at different concentrations of oxytetracycline

在第1～14天，各濃度土霉素對(duì)土壤中nirS基因代表的反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)組成影響并無(wú)明顯差異，78和115片段均為優(yōu)勢(shì)片段，分別約占22%～34%和11%～22%。而第30～60天時(shí)78 bp和115 bp的T-RFs比例逐漸下降，到第60天時(shí)最為明顯，分別約占8%～13%、7%～14%,而此時(shí)76 bp成為優(yōu)勢(shì)片段，約占16%～22%。這些結(jié)果間接表明雖然在不同濃度土霉素壓力脅迫對(duì)攜帶nirS基因的優(yōu)勢(shì)菌群的影響不大，但是隨著時(shí)間的增長(zhǎng)以及土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，土壤中的優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生了改變。

根據(jù)nirS基因T-RFs數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(圖2(B))，發(fā)現(xiàn)第一主成分PC1解釋了61.2%的物種變量，第二主成分PC2解釋了17.1%的物種變量。由圖看出不同濃度土霉素對(duì)主成分并沒(méi)有明顯的影響，但是可以觀察到第30天和第60天的各濃度組全分布在PC1的正軸，而第1、7、14天均在PC1的負(fù)軸，說(shuō)明可能隨著時(shí)間增長(zhǎng)，土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，土壤中攜帶nirS基因的優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生了變化。

而限制性?xún)?nèi)切酶HaeⅢ獲得22個(gè)nosZ基因片段(>1%)，分別為51 bp、54 bp、110 bp、111 bp、112 bp、113 bp、114 bp、115 bp、116 bp、131 bp、133 bp、134 bp、148 bp、149 bp、152 bp、153 bp、209 bp、210 bp、278 bp、279 bp、386 bp、392 bp(圖3(A))。從圖中可以看出1～60天，各濃度組土霉素藥物濃度對(duì)土壤中反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)組成影響亦并無(wú)明顯差異，其中209 bp和210 bp為優(yōu)勢(shì)片段，分別占21%～37%、9%～16%。隨著時(shí)間的增加，優(yōu)勢(shì)片段仍然是209 bp和210 bp，說(shuō)明土壤中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗亦并不能改變攜帶有nosZ基因的優(yōu)勢(shì)菌群。攜帶有209 bp和210 bp片段的微生物所占比例之和接近50%，也就是說(shuō)，含有nosZ基因的細(xì)菌較為固定，不易受外界影響。

根據(jù)nosZ基因T-RFs數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(圖3(B))，發(fā)現(xiàn)第一主成分PC1解釋了54.0%的物種變量，第二主成分PC2解釋了17.8%的物種變量。由圖3(B)可以看出第1天和第60天在PC1的正軸，而1、7、14、30、60天的均有濃度在PC2的正軸，但各藥物濃度對(duì)主成分沒(méi)有明顯的影響，說(shuō)明各濃度土霉素和土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)攜帶nosZ基因的優(yōu)勢(shì)片段并沒(méi)有太大的影響。

3 討論(Discussion)

反硝化作用在自然界中扮演重要的角色，其中主要由反硝化細(xì)菌起作用，而自然界中的反硝化菌群落結(jié)構(gòu)受到各種環(huán)境因素的影響[15]，主要有水分、溫度、pH、碳氮類(lèi)型、土壤質(zhì)地等等[8-10]。但是國(guó)內(nèi)關(guān)于抗生素對(duì)土壤反硝化作用影響的報(bào)道卻仍然較少，本試驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低、中濃度的土霉素對(duì)土壤中攜帶nirS、nirK反硝化基因菌群有促進(jìn)作用，而高濃度有抑制作用。而高濃度組nirS基因豐度在第14天有所上升，可能是部分?jǐn)y帶nirS基因菌群適應(yīng)抗生素壓力后的結(jié)果。nirK基因豐度在第7天時(shí)上升明顯，可能是施加雞糞對(duì)攜帶有nirK基因的菌群提供營(yíng)養(yǎng)，使其在短期內(nèi)豐度增加，之后隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，基因豐度也隨著下降。narG基因豐度在第14天時(shí)高濃度組高于其他各組，這可能與攜帶narG基因的菌群適應(yīng)高濃度的抗生素壓力后短時(shí)間內(nèi)菌群數(shù)量回升有關(guān)。但是隨著時(shí)間的增加，nirS、nirK、narG基因豐度均在緩慢下降，這與劉款[16]的研究相一致。nirS、nirK基因豐度變化規(guī)律除了第一天不同之外基本相同，有研究報(bào)道，nirS、nirK基因被認(rèn)為是外界壓力條件下的重要指示基因，兩者甚至可相互替代[17-18]，所以在第一天時(shí)nirS、nirK基因豐度表現(xiàn)不一致甚至相反。而nosZ基因豐度變化規(guī)律似乎與其他基因無(wú)關(guān)，在第60天時(shí)各濃度基因豐度增加，猜想可能是nosZ基因控制的氧化亞氮還原酶是反硝化最后一個(gè)過(guò)程，對(duì)抗生素壓力的反應(yīng)一開(kāi)始較為遲鈍，而隨時(shí)間的增加逐漸恢復(fù)敏感度。因?yàn)殛P(guān)于這個(gè)現(xiàn)象目前還沒(méi)有相關(guān)方面的報(bào)道,具體影響機(jī)制尚不清楚，有待后期進(jìn)一步試驗(yàn)證明。4個(gè)反硝化基因豐度變化趨勢(shì)不同說(shuō)明控制反硝化過(guò)程不同階段的酶對(duì)土霉素壓力下反應(yīng)不同，控制同一階段的酶可由2種或2種以上的基因共同決定，且其變化規(guī)律基本一致。

T-RFLP分析結(jié)果表明雖然土霉素各濃度對(duì)土壤中攜帶有nirS基因優(yōu)勢(shì)片段影響不大，但是雞糞作為有機(jī)肥料可能對(duì)優(yōu)勢(shì)片段的影響卻隨著時(shí)間的增加而改變。說(shuō)明攜帶有nirS基因的細(xì)菌可能更易受環(huán)境含碳氮物質(zhì)影響。這與尹昌[19]發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥的施加對(duì)土壤中nirS型反硝化菌種群的群落結(jié)構(gòu)和豐度有顯著影響的結(jié)果相一致。而攜帶有nosZ基因的菌群卻表現(xiàn)出較為穩(wěn)定的趨勢(shì)，各不同濃度的土霉素藥物以及雞糞都對(duì)其優(yōu)勢(shì)片段沒(méi)有太大的影響。說(shuō)明施肥和抗生素壓力對(duì)nosZ基因群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)影響均不顯著。這與之前的學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)一致，即不同環(huán)境條件下nosZ基因群落組成變化不大[20-21]，nosZ基因在土壤中表現(xiàn)相對(duì)穩(wěn)定，不易受到外界環(huán)境的影響[17,22]。亞硝酸還原酶(nir)比氧化亞氮還原酶(nos)對(duì)外界環(huán)境條件變化的響應(yīng)更加敏感，這可能與反硝化進(jìn)行的深度有關(guān)。換句話說(shuō)，土霉素對(duì)反硝化過(guò)程的前2個(gè)環(huán)節(jié)影響較大，而對(duì)最后一個(gè)環(huán)節(jié)的還原影響較小。這也同時(shí)可以解釋為什么常把nirS作為環(huán)境中反硝化菌群變化的指示基因,而不選擇nosZ基因的原因。

本實(shí)驗(yàn)還存在的不足之處是沒(méi)有進(jìn)一步跟蹤雞糞作為碳源以及土霉素隨時(shí)間的增加而消耗和降解的動(dòng)態(tài)過(guò)程，有必要在今后的研究中增加土壤中總碳含量的變化規(guī)律以及抗生素殘留的檢測(cè)，以得到更加充分的數(shù)據(jù)支持。

綜上，本試驗(yàn)通過(guò)模擬室內(nèi)施糞菜地土壤模型，研究土霉素脅迫下反硝化分子的響應(yīng)特征，通過(guò)熒光定量和用T-RFLP技術(shù)，可以初步得到以下結(jié)論：

(1)低(20 μg·kg-1)、中(200 μg·kg-1)濃度土霉素可以促進(jìn)土壤反硝化基因的響應(yīng)速度，而高濃度(2 000 μg·kg-1)則有抑制作用。說(shuō)明長(zhǎng)期施加含有低、中濃度范圍的畜禽糞便對(duì)土壤中氮肥會(huì)造成損失，不利于農(nóng)作物的生長(zhǎng)。而高濃度則會(huì)直接抑制土壤菌群的生長(zhǎng)，對(duì)土壤微生物造成破壞。

(2)反硝化基因nirS相比nosZ基因來(lái)說(shuō)對(duì)環(huán)境變化更加敏感，更適合作為反硝化作用變化的指示基因和分子標(biāo)記。

致謝：感謝國(guó)家自然科學(xué)基金(31772803)；廣東省自然科學(xué)基金(2016A030311029)給予的支持。