胚胎期草甘膦銨鹽暴露對(duì)中華鱉幼體的表型與生理表現(xiàn)的影響

葉夢(mèng)婷，傅詩(shī)雨，岑綺雯，吳瓊，胡英超，陸洪良

杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院生態(tài)系統(tǒng)保護(hù)與恢復(fù)杭州市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310036

草甘膦，英文名glyphosate，學(xué)名N-(膦?；谆?甘氨酸，商品名農(nóng)達(dá)(Roundup)，分子式C3H8NO5P，是全球范圍內(nèi)最為普遍使用的一種廣譜性有機(jī)磷除草劑，其通過莖葉吸收進(jìn)入植物體內(nèi)，抑制氨基酸的生物合成，干擾光合作用，從而使有害雜草枯死[1]。草甘膦純品為白色固體，水溶性差，實(shí)際生產(chǎn)中通常制成易溶于水的草甘膦胺鹽。草甘膦是全球生產(chǎn)應(yīng)用最大的除草劑，約占全球除草劑總用量的30%。雖然我國(guó)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植少，草甘膦國(guó)內(nèi)需求量較小，但我國(guó)是草甘膦最大生產(chǎn)國(guó)，產(chǎn)量占全球80%以上[2]。雖然草甘膦在自然水體中降解快速，但部分殘留物及其降解產(chǎn)物容易被水底沉積物吸附。據(jù)報(bào)道，在美國(guó)一些河流中草甘膦殘留濃度達(dá)到2.2 mg·L-1[3]；而我國(guó)太湖水體中被檢出的草甘膦含量最高可達(dá)15 mg·L-1[4]。

草甘膦的安全性仍存在爭(zhēng)議，美國(guó)環(huán)保署等在內(nèi)的多個(gè)研究機(jī)構(gòu)將其毒性分在低毒等級(jí)[5]。低劑量草甘膦處理甚至?xí)@示出刺激生長(zhǎng)效應(yīng)[6]。在草甘膦制劑生產(chǎn)實(shí)踐中，為提高其除草效率常添加表面活性劑作為助力劑，應(yīng)用中的草甘膦制劑的毒性主要源自于表面活性劑。草甘膦制劑的急性毒性效應(yīng)在不同動(dòng)物類群中存在較大差異[7-11]。例如，一些蛙類蝌蚪和魚類24 h或48 h的半數(shù)致死濃度(median lethal concentration, LC50)為2.4～18.1 mg·L-1[8-10]；克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)幼體48 h的LC50值則為4.06×103mg·L-1[11]。草甘膦與其他農(nóng)藥、重金屬等污染物具交互作用而顯示聯(lián)合毒性[12-13]。許多研究表明草甘膦是一種典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾化合物(endocrine disrupting chemical)[14-15]。草甘膦制劑被認(rèn)為具有抗雄激素活性(antiandrogenic activity)，可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合雄激素受體(androgen receptor)，誘導(dǎo)改變雄激素受體蛋白表達(dá)，引起雌激素水平增加而導(dǎo)致個(gè)體雌性化[16]；草甘膦制劑還可能具有肥胖效應(yīng)，長(zhǎng)期給老鼠注射低劑量草甘膦制劑可能會(huì)引起肝臟脂類的積累而導(dǎo)致脂肪肝[17]。此外，在針對(duì)魚類的測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，一定劑量的草甘膦處理會(huì)引起魚類生理代謝方面的改變。例如，草甘膦制劑處理導(dǎo)致銀魚(Rhamdiaquelen)肝臟中葡萄糖含量的減少，腦中乙酰膽堿脂酶活性降低，但肌肉中葡萄糖、脂質(zhì)過氧化物等含量增加，肝臟和肌肉乳酸增加等一系列的反應(yīng)[18]。金魚(Carassiusauratus)在不同濃度的草甘膦制劑中靜態(tài)暴露后，肝臟羥基信號(hào)強(qiáng)度和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量增加，但超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性降低；而動(dòng)態(tài)暴露后肝臟羥基信號(hào)增加，MDA含量隨時(shí)間先增加后降低[19]。

草甘膦對(duì)水生動(dòng)物毒理的研究主要集中于魚類、兩棲類動(dòng)物[7-9,18-21]，很少有涉及水生或半水生爬行動(dòng)物(龜鱉類和鱷類)。龜鱉類爬行動(dòng)物是一個(gè)特化類群，許多種類存活時(shí)間很長(zhǎng)。它們生活于含有農(nóng)藥殘留的水體環(huán)境時(shí)，殘留物可能在其體內(nèi)不斷累積，因而對(duì)其造成長(zhǎng)期的毒害[22]。僅有的幾例研究顯示：草甘膦制劑能夠影響紅耳滑龜(Trachemysscriptaelegans)胚胎發(fā)育，雖然在較低濃度處理下孵出個(gè)體變化不明顯，但高濃度下孵出個(gè)體較小[23]；其他一些殺蟲劑(例如氯丹、反式九氯、二氯二苯三氯乙烷)可能改變紅耳滑龜孵出幼體的大小和性別[24]。中華鱉野外分布很廣，在我國(guó)、日本、越南、韓國(guó)等都能見到。中華鱉具有較大的食用及藥用價(jià)值，我國(guó)各地已廣泛養(yǎng)殖，是最重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物種類之一。中華鱉通常養(yǎng)在緊鄰農(nóng)田的池塘中，在農(nóng)田施用的農(nóng)藥殘留物可能隨水流進(jìn)入這些養(yǎng)殖池塘。然而，農(nóng)藥施用對(duì)養(yǎng)殖中華鱉毒理效應(yīng)以及相關(guān)安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)未見有報(bào)道。本文用不同濃度的草甘膦銨鹽處理孵化過程中的中華鱉(Pelodiscussinensis)卵以檢測(cè)草甘膦制劑對(duì)其胚胎發(fā)育、孵出幼體形態(tài)、運(yùn)動(dòng)及生理表現(xiàn)的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 溶液配制與中華鱉卵收集

實(shí)驗(yàn)用除草劑為浙江新安化工集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)的草甘膦銨鹽(C3H11N2O5P)，草甘膦含量為68%(固體樣本送上海微譜化工技術(shù)服務(wù)有限公司檢測(cè)，用液相色譜質(zhì)譜分析實(shí)測(cè)含量為68%～70%)。稱取1 g草甘膦銨鹽放入燒杯中，加入135 mL蒸餾水后攪拌，配制成濃度為5 000 mg·L-1的草甘膦鹽溶液。然后，取已制備的5 000 mg·L-1草甘膦銨鹽溶液加入蒸餾水分別稀釋10、100和1 000倍，以配制成500、50和5 mg·L-1的草甘膦銨鹽溶液。將不同濃度的草甘膦銨鹽溶液轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，然后放置在4 ℃冷藏箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)用200枚已受精的中華鱉(具受精白斑的卵被認(rèn)為是受精卵)卵購(gòu)自杭州市余杭區(qū)某龜鱉養(yǎng)殖場(chǎng)。所有卵均于產(chǎn)出當(dāng)天收集，隨后運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。每一枚卵用Mitutoyo數(shù)顯游標(biāo)卡尺(型號(hào)：CD-15AXWW，日本川崎市，Mitutoyo Corporation)測(cè)定卵徑(精確到0.01 mm)；用Mettler-Toledo電子天平(型號(hào)：PB303-N，中國(guó)上海，Mettler-Toledo儀器(上海)有限公司)稱重(精確到0.001 g)、用HB中華鉛筆在卵表面編上序號(hào)。然后，將卵隨機(jī)均等地分配到5個(gè)不同草甘膦銨鹽濃度處理組(對(duì)照組0、5、50、500和5 000 mg·L-1)處理(每組40枚卵，同窩卵分配于不同處理)。卵半埋于內(nèi)含潮濕基質(zhì)(-220 kPa，按重量干蛭石:水= 1:1混合)的孵化盒中，卵白斑朝上。所有孵化盒均放置溫度預(yù)先設(shè)置為30 ℃的人工氣候室內(nèi)，每3日對(duì)孵化盒稱重并補(bǔ)充基質(zhì)散失的水分以保持基質(zhì)濕度恒定。

1.2 中華鱉卵處理

用點(diǎn)光源確定中華鱉卵胚胎位置，并用無毒記號(hào)筆畫上記號(hào)。每天上午10:00—12:00，用移液槍吸取100 μL相應(yīng)濃度的草甘膦銨鹽溶液，小心涂抹于每個(gè)中華鱉卵的胚胎位置上方表面(濃度為0 mg·L-1的對(duì)照組則吸取100 μL蒸餾水涂抹于中華鱉卵表面)[23]。處理同時(shí)檢查鱉卵的發(fā)霉情況，及時(shí)清除表面霉菌斑點(diǎn)或移除霉變的卵。

1.3 幼體大小與運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)

待有少量幼體破殼，每組中隨機(jī)取5枚未破殼的卵解剖取幼體肝臟用于相應(yīng)生理指標(biāo)檢測(cè)外，其余卵正常孵化。孵化時(shí)間記為養(yǎng)殖場(chǎng)卵產(chǎn)出至幼體破殼的間隔天數(shù)，孵化率用每一處理中幼體破殼個(gè)數(shù)占入孵卵數(shù)(不計(jì)入用于解剖的5枚卵)的比例表示。檢查孵出幼體畸形情況，用Mettler-Toledo電子天平測(cè)量其體重，用Mitutoyo數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量其背甲長(zhǎng)和背甲寬。待腹部卵黃完全吸收后，在30 ℃體溫條件下測(cè)定幼體運(yùn)動(dòng)(游泳)表現(xiàn)和活動(dòng)水平。實(shí)驗(yàn)前1小時(shí)將幼體放置在溫度預(yù)先設(shè)定為30 ℃的FPQ型人工氣候箱(型號(hào)：PQX-330AY-12H，中國(guó)寧波，寧波萊福科技有限公司)內(nèi)以控制其體溫，然后放入含有10 cm水高(水溫預(yù)先控制在30 ℃)的直形水槽(120 cm × 15 cm × 20 cm)的一端，一人用筆刷驅(qū)趕，另一人用Panasonic數(shù)碼攝像機(jī)(型號(hào)：HDC-HS900，日本大阪，Panasonic corporation)記錄幼鱉在跑道中一個(gè)游泳來回的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)，視頻片段用MGI Video Wave III軟件(MGI Software Co., Canada)讀出，游泳速度用幼體游過20 cm的最大速度表示?；顒?dòng)水平在30 ℃的恒溫室中進(jìn)行測(cè)定，每一處理組隨機(jī)選取10只幼體，單獨(dú)放置于敞口的圓筒盒內(nèi)，盒內(nèi)水溫約30 ℃。用數(shù)碼攝像機(jī)在下午12:00—16:00錄制4 h視頻，視頻片段用MGI Video Wave III軟件讀出，活動(dòng)水平用視頻錄制期間幼體有活動(dòng)的時(shí)間比例表示。

1.4 后期胚胎肝臟生理指標(biāo)

每組中隨機(jī)取出孵化后期的5枚卵(透過卵殼觀察卵內(nèi)幼體背甲已著色)，小心打開卵殼取出幼體并解剖將其肝臟分離，用電子天平稱取肝臟重量，旋即放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。取小部分肝臟組織并稱重，加入400 μL甲醇，組織打碎，-20 ℃冰箱放置24 h，然后加入800 μL氯仿和200 μL dH2O，震蕩、離心，分別取上層和下層清液轉(zhuǎn)移至棕色小瓶中，均放于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

購(gòu)買南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的甘油三酯(TG)試劑盒、考馬斯亮藍(lán)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒。取保存的肝臟組織下清液，按甘油三酯試劑盒說明書要求測(cè)定肝臟甘油三酯含量；取上清液，按考馬斯亮藍(lán)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒說明書要求分別測(cè)定肝臟總蛋白質(zhì)含量、SOD活力和MDA含量。

1.5 肝臟熱激蛋白70基因表達(dá)

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Statistica 6.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行參數(shù)統(tǒng)計(jì)分析前，分別檢驗(yàn)其正態(tài)性(Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn))和方差同質(zhì)性(Bartlett檢驗(yàn))。用單因子方差分析檢測(cè)草甘膦銨鹽處理對(duì)中華鱉卵孵化期、孵出幼體游泳速度、活動(dòng)水平及肝臟生理指標(biāo)的影響；以卵重為協(xié)變量的單因子協(xié)方差分析檢測(cè)草甘膦銨鹽處理對(duì)孵出幼體大小(體重、背甲長(zhǎng)和背甲寬)的影響。文中涉及的非參數(shù)統(tǒng)計(jì)為G檢驗(yàn)。描述性統(tǒng)計(jì)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著性水平設(shè)置為α= 0.05。

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同濃度草甘膦除草劑對(duì)中華鱉胚胎發(fā)育的影響

入孵的中華鱉卵均為受精卵，在孵化過程中可見的受精白斑在卵表面逐漸增大至整枚卵完全變白。不同組孵入的卵大小無顯著的差異(卵重：F4 195= 0.25,P= 0.909；卵直徑：F4 195= 0.70,P= 0.606)(表1)。線性回歸分析顯示孵化時(shí)間與入孵卵重?zé)o顯著相關(guān)性(r= 0.04,F1 147= 0.30,P= 0.588)。不同草甘膦除草劑濃度處理對(duì)中華鱉卵孵化時(shí)間的影響不顯著(F4 144= 2.00,P= 0.103，表1)。500 mg·L-1組的卵孵化成功率略低，但在統(tǒng)計(jì)上5個(gè)濃度處理下的孵化成功率差異不顯著(G= 4.88,df= 4,P= 0.300，表1)。

2.2 不同濃度草甘膦除草劑對(duì)中華鱉幼體大小和活動(dòng)水平的影響

以卵重為協(xié)變量的協(xié)方差分析顯示：不同草甘膦除草劑濃度處理對(duì)中華鱉孵出幼體的大小無顯著影響(體重：F4 143= 0.27,P= 0.896；背甲長(zhǎng)：F4 143= 1.31,P= 0.268；背甲寬：F4 143= 1.28,P= 0.281)(圖1)。游泳測(cè)試中，小部分個(gè)體不游動(dòng)或僅有少量游動(dòng)，相應(yīng)個(gè)體數(shù)據(jù)未用于后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。不同草甘膦除草劑濃度處理對(duì)中華鱉孵出幼體的游泳速度無顯著影響(F4 138= 0.72,P= 0.578, 圖2)。但是，從每組中隨機(jī)選取10只中華鱉幼體的活動(dòng)水平存在顯著的組間差異(F4 45= 3.14,P= 0.023)?；顒?dòng)水平隨著草甘膦除草劑濃度增加出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖2)。對(duì)照組個(gè)體80%的時(shí)間表現(xiàn)活躍，50 mg·L-1組的活動(dòng)時(shí)間達(dá)到最大(93%)，但是5 000 mg·L-1組又下降到對(duì)照組水平(77%)。

表1 不同草甘膦除草劑濃度處理下中華鱉入孵卵大小、孵化率及孵化時(shí)間Table 1 Egg size, hatching success and incubation period of Pelodiscus sinensis under different concentration treatments of glyphosate-ammonium

圖1 不同處理組孵出中華鱉幼體的大小Fig. 1 The size of Pelodiscus sinensis hatchlings from different concentration treatments of glyphosate-ammonium

2.3 不同濃度草甘膦除草劑對(duì)中華鱉幼體肝臟甘油三酯含量、超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量的影響

解剖獲得的中華鱉破殼前幼體的肝臟中，甘油三酯含量、超氧化物歧化酶活性以及丙二醛含量均無顯著的組間差異(TG：F4 16= 1.16,P= 0.363；SOD：F4 16= 2.67,P= 0.094；MDA：F4 16= 1.75,P= 0.188)(圖3)。

圖2 不同處理組孵出中華鱉幼體的游泳速度和活動(dòng)水平注：不同字母表示平均值差異顯著，Tukey’s test，a > b。Fig. 2 Swimming performance and activity level of Pelodiscus sinensis hatchlings from different concentration treatments of glyphosate-ammoniumNote: Means with different superscripts in the lower graph are statistically different. Tukey’s test, a > b.

2.4 不同濃度草甘膦除草劑對(duì)中華鱉幼體肝臟Hsp70基因表達(dá)的影響

草甘膦除草劑處理有導(dǎo)致破殼前幼體肝臟中熱激蛋白70表達(dá)水平上調(diào)的趨勢(shì)，但是熱激蛋白70 mRNA相對(duì)表達(dá)量無顯著的組間差異(F4 10= 1.30,P= 0.332)(圖4)。

3 討論(Discussion)

圖3 不同濃度處理中華鱉幼體肝臟甘油三脂含量、超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量Fig. 3 Triglyceride level, superoxide dismutase activity and malonaldehyde content in the livers of Pelodiscus sinensis hatchlings from different concentration treatments of glyphosate-ammonium

動(dòng)物胚胎發(fā)育期是最脆弱的階段，該時(shí)期的農(nóng)藥暴露可能影響其存活以及產(chǎn)出后幼體的生長(zhǎng)發(fā)育。不同草甘膦除草劑濃度處理組的中華鱉卵孵化率差異并不大。相似的研究的結(jié)果也見于其他龜鱉類動(dòng)物。例如，一定濃度范圍的草甘膦制劑處理(68～1 501 mg·L-1)對(duì)紅耳滑龜卵的孵化成功率的影響不大(80%～100%)，僅11 206 mg·L-1濃度處理下孵化成功率較低(73%)[23]。已有的一些研究顯示包括除草劑、殺蟲劑在內(nèi)的農(nóng)藥對(duì)龜鱉和鱷類動(dòng)物卵孵化的影響并不總展現(xiàn)明顯的致死效應(yīng)。例如，在一定劑量范圍內(nèi)，二氯二苯三氯乙烷暴露并不影響綠海龜(Cheloniamydas)和紅耳滑龜?shù)穆逊趸晒β蔥24-25]；同樣，殺蟲劑毒殺芬(toxaphene)和溴氰菊酯(deltamethrin)暴露不影響美洲短吻鱷(Alligatormississippiensis)、紅耳滑龜和烏龜(Chinemysreevesii)卵孵化率[26-27]；異丙甲草胺等除草劑暴露也并沒有引起北美擬鱷龜(Chelydraserpentina)卵孵化率的顯著下降[28]。然而，在魚類及兩棲類動(dòng)物的胚胎測(cè)試中，農(nóng)藥暴露常使其胚胎致畸或致死[29-30]。除不同有機(jī)農(nóng)藥的毒性差異、動(dòng)物胚胎大小類群間差異所產(chǎn)生農(nóng)藥暴露胚胎致死效應(yīng)差異外，農(nóng)藥殘余物從環(huán)境中轉(zhuǎn)至卵內(nèi)累積的效率差別也可能是一個(gè)重要方面。卵殼特征(例如蛋殼結(jié)構(gòu)與通透性)和卵孵化時(shí)周邊基質(zhì)性能的差異會(huì)使農(nóng)藥殘余物遷移效率存在差別，從而使不同動(dòng)物類群在農(nóng)藥暴露時(shí)出現(xiàn)不同的胚胎致死效應(yīng)[31]。龜鱉和鱷類動(dòng)物卵外面具有較堅(jiān)硬的殼，而魚類和兩棲類動(dòng)物卵外面僅有高通透性的膜，所以有機(jī)磷農(nóng)藥分子更容易透過魚類和兩棲類動(dòng)物外層卵膜并在卵內(nèi)累積而使其胚胎致畸致死[31]。

圖4 不同處理組中華鱉后期胚胎肝臟中Hsp70 mRNA的表達(dá)情況Fig. 4 Relative mRNA expression of heat shock protein 70 in the livers of Pelodiscus sinensis hatchlings from different concentration treatments of glyphosate-ammonium

胚胎期低劑量農(nóng)藥暴露并不一定直接引起畸形或死亡，但可能會(huì)長(zhǎng)期地影響孵出幼體的表現(xiàn)。不同濃度處理組孵出的中華鱉幼體大小和游泳能力無顯著差異，這與已有報(bào)道的其他農(nóng)藥處理卵生爬行動(dòng)物的結(jié)果有差異。例如，草甘膦、毒殺芬和硫丹處理會(huì)分別使紅耳滑龜、美洲短吻鱷和寬吻凱門鱷(Caimanlatirostris)孵出幼體減小[23,26,32]。較高濃度農(nóng)藥處理可能會(huì)引起胚胎能量消耗增加，從而導(dǎo)致孵出幼體偏小[23-24]。然而，草甘膦處理并不影響幼體肝臟甘油三酯含量，可能部分地反映草甘膦除草劑處理后中華鱉胚胎能量消耗變化不大，而不會(huì)改變孵出幼體的大小。卵生動(dòng)物胚胎期農(nóng)藥暴露對(duì)其胚后生長(zhǎng)的影響可能是長(zhǎng)期的。由于本研究未測(cè)定中華鱉孵出幼體后期的生長(zhǎng)情況，因而無法確定胚胎期草甘膦暴露的有害效應(yīng)是否會(huì)在后期出現(xiàn)。有意思的是，孵出幼體的活動(dòng)水平隨草甘膦除草劑濃度的增加先上升后下降。可能說明：較低濃度的草甘膦除草劑暴露促進(jìn)孵出幼體增加覓食時(shí)間以獲取較多食物來使其生長(zhǎng)快速，較高濃度暴露則使幼體降低覓食活動(dòng)，而導(dǎo)致其生長(zhǎng)緩慢。

草甘膦已被認(rèn)定屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，人或動(dòng)物胚胎期的暴露可能會(huì)引起機(jī)體內(nèi)分泌失衡而造成生長(zhǎng)發(fā)育異常[16]。與其他有機(jī)磷農(nóng)藥相似，草甘膦具有抗雄性激素活性，會(huì)干擾類固醇合成而阻斷性別決定途徑，使性器官形成發(fā)生逆轉(zhuǎn)，將雄性個(gè)體轉(zhuǎn)變成雌性個(gè)體[26,33]。例如，多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls)、水體中殘留的二氯二苯三氯乙烷使紅耳滑龜、佛羅里達(dá)紅腹龜(Chrysemysnelsoni)、美洲短吻鱷等種類雄性胚胎雌性化[33-36]。由于新生幼鱉的性別難以鑒定、生長(zhǎng)緩慢，本研究并沒有性別方面數(shù)據(jù)，草甘膦是否會(huì)改變中華鱉的性別決定有待于進(jìn)一步確定。

隨著草甘膦除草劑濃度的增加，中華鱉幼體肝臟甘油三酯含量有略微下降，但差異不顯著。具抗雄性激素活性化合物暴露導(dǎo)致肝臟甘油三酯含量下降在其他動(dòng)物種類中有發(fā)現(xiàn)。例如，給雄性老鼠投喂氟他胺(flutamide)會(huì)導(dǎo)致其肝臟甘油三酯含量顯著下降[37]。然而，在其他研究中發(fā)現(xiàn)抗雄性激素活性化合物暴露會(huì)降低脂肪水解酶的活性，或者具有雌激素化合物類似效應(yīng)(增加體內(nèi)雌激素含量或提高雌激素/雄激素比例)而導(dǎo)致肝臟脂肪積累，進(jìn)而使甘油三酯含量上升[38-39]。最近的一項(xiàng)針對(duì)老鼠的研究顯示草甘膦暴露會(huì)導(dǎo)致其肝臟脂肪積累[17]，因此這種抗雄性激素活性化合物的肥胖效應(yīng)在不同物種是否存在差異仍需更多的數(shù)據(jù)來支持。SOD是機(jī)體抗氧化、清除自由基的主要酶類；MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，其含量高低可間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度。中華鱉幼體肝臟SOD活性隨草甘膦除草劑濃度增加無顯著變化，這與一些其他物種的研究結(jié)果不一致。魚類、兩棲類動(dòng)物中草甘膦暴露通常會(huì)導(dǎo)致肝臟SOD活性上升[40-41]；僅在少數(shù)研究中顯示相反的趨勢(shì)[19,42]。草甘膦暴露可能會(huì)誘發(fā)機(jī)體脂質(zhì)氧化反應(yīng)，因而導(dǎo)致肝臟MDA含量上升[19]。本研究中草甘膦暴露對(duì)中華鱉肝臟MDA含量的影響并不大。

Hsp70蛋白在生物體受到環(huán)境脅迫時(shí)會(huì)大量表達(dá)，是反映環(huán)境污染程度的有效生物學(xué)標(biāo)志物。Hsp70蛋白在動(dòng)物表現(xiàn)環(huán)境耐受能力時(shí)起到很保守的作用，其應(yīng)對(duì)外源性物質(zhì)暴露的表達(dá)是機(jī)體出現(xiàn)的保護(hù)性反應(yīng)。不同濃度草甘膦除草劑處理組的中華鱉幼體肝臟Hsp70相對(duì)表達(dá)量在統(tǒng)計(jì)上差異不顯著。但是，隨著草甘膦除草劑濃度的增加，Hsp70表達(dá)水平呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)，這種反應(yīng)可能有助于減少草甘膦對(duì)發(fā)育過程中胚胎的傷害。草甘膦暴露導(dǎo)致Hsp70表達(dá)上調(diào)的結(jié)果也見于其他物種(例如，秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans)[43]。然而，不同環(huán)境內(nèi)分泌干擾化合物暴露產(chǎn)生熱激蛋白表達(dá)趨勢(shì)并不一致。壬基酚(4-nonylphenol)和辛基酚(4-t-octylphenol)暴露導(dǎo)致潮間帶橈足動(dòng)物(Tigriopusjaponicus)Hsp70表達(dá)下調(diào)，但雙酚A(bisphenol A)暴露會(huì)導(dǎo)致其表達(dá)上調(diào)[44]。

在不同濃度的草甘膦除草劑處理下，絕大多數(shù)檢測(cè)的中華鱉幼體表型與生理指標(biāo)無顯著的組間差異。經(jīng)一段時(shí)間降解，土壤中草甘膦的殘留量并不高(例如，農(nóng)田施用草甘膦21 d后，可檢測(cè)到的殘留量為0.008～1.0 mg·L-1[45])。雖然自然環(huán)境條件下孵化的中華鱉卵表面均會(huì)接觸土壤，但土壤草甘膦殘留量遠(yuǎn)低于本研究的測(cè)試濃度，因此可以推測(cè)自然環(huán)境中中華鱉胚胎發(fā)育受土壤殘留草甘膦的毒害作用應(yīng)很小。結(jié)果也表明：胚胎期草甘膦除草劑暴露對(duì)中華鱉的胚胎發(fā)育、孵出幼體的影響小于魚類、兩棲類等其他水生動(dòng)物，亦小于柔性殼卵的紅耳滑龜。這種差異可能來自于不同動(dòng)物類群卵構(gòu)造上的差別。與魚類、兩棲類動(dòng)物卵外層高通透性的膜相比，龜鱉類動(dòng)物卵厚實(shí)的外殼能更好地抵御污染物的進(jìn)入。本文初步分析不同草甘膦除草劑濃度處理對(duì)中華鱉胚胎發(fā)育的潛在毒理效應(yīng)，為進(jìn)一步評(píng)估龜鱉養(yǎng)殖中因農(nóng)藥污染所引起的安全風(fēng)險(xiǎn)提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。