王裕鵬

(海南省洋浦經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)洋浦中學(xué) 578000)

人教版高中生物學(xué)教材選修3中提到，將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法中采用最多的是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，其中根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞中的Ti質(zhì)粒在整個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。本文就Ti質(zhì)粒相關(guān)知識(shí)進(jìn)行梳理和總結(jié)。

1 Ti質(zhì)粒的分類和結(jié)構(gòu)

1.1 Ti質(zhì)粒的分類 農(nóng)桿菌是一類能侵染植物受損傷部位，進(jìn)而引起植物細(xì)胞產(chǎn)生冠癭堿和毛狀根的革蘭氏陰性土壤桿菌。它包括根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌兩類。而致瘤質(zhì)粒(tumor-inducing plasmid，簡(jiǎn)稱為Ti質(zhì)粒)是根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞擬核區(qū)外分離到的一種能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，長(zhǎng)度約為200～250Kb。Ti質(zhì)?？梢哉T導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生不同種類的冠癭堿，根據(jù)產(chǎn)生冠癭堿的類型，Ti質(zhì)?？梢苑譃?類： 章魚堿型、胭脂堿型、農(nóng)桿堿型和琥珀堿型[1]。

1.2 Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu) 從結(jié)構(gòu)上看，Ti質(zhì)粒包括T-DNA區(qū)、毒性區(qū)、接合轉(zhuǎn)移區(qū)和復(fù)制起始區(qū)4部分。其中，T-DNA區(qū)和毒性區(qū)參與了外源基因的轉(zhuǎn)移整合，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)如下： ①T-DNA區(qū)。該區(qū)是根癌農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，Ti質(zhì)粒在相關(guān)蛋白的作用下被切割下來(lái)整合至植物基因組的一段DNA分子。該區(qū)段分布一些與激素合成相關(guān)的基因，其表達(dá)產(chǎn)物能引起植物細(xì)胞激素紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的形成。由于Ti質(zhì)粒類型不同，T-DNA長(zhǎng)度也有所不同，總體介于12～24Kb之間。其最重要的區(qū)域是分別位于左右兩端邊界處25bp的重復(fù)序列，兩者在T-DNA轉(zhuǎn)移外源基因整合至植物基因組中發(fā)揮功能，其中右邊界序列的作用更為重要。②毒性區(qū)(Vir區(qū))。該區(qū)是位于T-DNA以外的一段DNA分子，長(zhǎng)度介于30～40Kb之間。不同類型的Ti質(zhì)粒Vir區(qū)結(jié)構(gòu)也有所不同，以胭脂堿型Ti質(zhì)粒為例，其Vir區(qū)有7個(gè)操縱子，共22個(gè)基因，分別為VirA,VirB1-VirB11,VirC1,VirC2,VirD1-D4,VirE1,VirE2,VirG,Virtzs。這些基因編碼的蛋白質(zhì)在T-DNA轉(zhuǎn)移整合中起輔助作用，其本身不會(huì)與植物基因組整合[2]。

2 Ti質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化機(jī)理

在過(guò)去的幾十年間，關(guān)于根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的分子機(jī)制得到了廣泛研究。目前，人們普遍認(rèn)同Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化過(guò)程可分為8個(gè)相互關(guān)聯(lián)的階段[3]，分別為： ①當(dāng)植物受到創(chuàng)傷后，會(huì)分泌酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向植物細(xì)胞，然后與植物細(xì)胞相關(guān)受體蛋白特異性結(jié)合；②VirA蛋白是位于細(xì)菌細(xì)胞膜上能識(shí)別植物酚類化合物的受體蛋白，兩者結(jié)合后引發(fā)VirG蛋白的磷酸化；③由于VirG蛋白磷酸化，使其從非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變至活性狀態(tài)，并作為激活因子結(jié)合至其他Vir基因的啟動(dòng)子上，開啟Vir基因表達(dá)；④VirD1和VirD2蛋白作用于T-DNA的底鏈上，將其切割形成單鏈T-DNA分子(即T-strand)；同時(shí)VirD2蛋白以共價(jià)方式連接在T-strand的5′端，形成一個(gè)不成熟T鏈復(fù)合物；⑤VirD4和VirB類蛋白結(jié)合形成具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能的通道，協(xié)助不成熟T鏈復(fù)合物和一些Vir蛋白進(jìn)入植物細(xì)胞中；⑥在轉(zhuǎn)運(yùn)途中，VirE2蛋白包被在不成熟T鏈復(fù)合物上，構(gòu)成成熟T鏈復(fù)合物；⑦成熟T鏈復(fù)合物和一些植物細(xì)胞蛋白(Ran、 VIP1等)進(jìn)一步識(shí)別結(jié)合，協(xié)助T鏈復(fù)合物經(jīng)核孔到達(dá)細(xì)胞核；⑧在VirD2、 VirE2和植物細(xì)胞相關(guān)蛋白的協(xié)助下，T-strand與植物細(xì)胞基因組完成整合。

3 Ti質(zhì)粒在實(shí)際應(yīng)用中的改造

高中生物學(xué)教材提到用于基因工程的載體分子量并不大： 如TA克隆用到的pMD19質(zhì)粒長(zhǎng)度僅有2692bp，原核表達(dá)蛋白質(zhì)常用質(zhì)粒pET-28a長(zhǎng)度也只有5369bp。而Ti質(zhì)粒長(zhǎng)度約200Kb左右，片段過(guò)大，不易操作。所以野生型Ti質(zhì)粒需改造才能應(yīng)用于植物基因工程。

關(guān)于Ti質(zhì)粒的改造方法中最常見的是雙元載體系統(tǒng)[1]。前面提到Vir區(qū)對(duì)T-DNA的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，但它并沒(méi)有和T-DNA區(qū)連在一起?；诖?，可以把這兩個(gè)區(qū)段分別改造到兩個(gè)質(zhì)粒上。通常是將含T-DNA的質(zhì)粒稱之為微型Ti質(zhì)粒，它缺失Vir基因，但含有復(fù)制起點(diǎn)、標(biāo)記基因和多克隆位點(diǎn)，能整合外源基因。由于該質(zhì)粒在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中均可以復(fù)制保存，也稱之為大腸桿菌-農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒。將含一整套Vir區(qū)基因但缺失T-DNA區(qū)的質(zhì)粒稱之為輔助Ti質(zhì)粒。兩種質(zhì)粒構(gòu)建完成后，采用一定的方法將它們轉(zhuǎn)入同一株農(nóng)桿菌中，構(gòu)成雙元載體系統(tǒng)，就能使T-DNA整合至植物基因組中。此外，人們還建立了共整合載體、超級(jí)雙元載體等系統(tǒng)。

4 Ti質(zhì)粒在基因工程中的適用范圍

早期研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法主要適用于雙子葉植物和裸子植物。因?yàn)橄裼衩?、水稻和小麥等多種單子葉植物對(duì)農(nóng)桿菌的感染持抗拒態(tài)度。但是隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，該項(xiàng)技術(shù)得到了優(yōu)化，使其逐步成為轉(zhuǎn)化單子葉植物的常規(guī)手段。其優(yōu)化策略主要包括以下幾個(gè)方面： ①添加表面活性劑增強(qiáng)農(nóng)桿菌和植物細(xì)胞間的吸附能力；②人為提高酚類化合物的含量，更加高效地激活Vir基因表達(dá)；③采用超聲波處理植物，使植物組織形成微傷口，增加農(nóng)桿菌的感染幾率；④添加抗氧化劑去除植物細(xì)胞由于農(nóng)桿菌感染形成的過(guò)氧化物，減少植物組織培養(yǎng)中愈傷組織的褐化，提高轉(zhuǎn)化效率[4]。

目前，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的適用范圍已超出了植物界，并延伸至芽殖酵母、裂殖酵母和多種絲狀真菌等生物中。由于簡(jiǎn)單有效，該基因傳遞系統(tǒng)同樣成為了真菌遺傳改良中極為有效的工具之一[5]。更為重要的是，有人發(fā)現(xiàn)根癌農(nóng)桿菌可以轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞，這為研究該方法能否適用于人類細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)[6]。