段如雁,韋小麗，安常蓉

（1.貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽550025；2.貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009）

生物固氮是指自然界中的一些微生物將大氣中的不能被植物利用的氮氣還原成可利用的氨的過程。豆目Fabales樹種與根瘤菌在長期進化過程中形成的共生固氮體系是生物固氮中效率最高的體系，所固定的氮素約占生物固氮總量的 65%，它可以導(dǎo)致植物的氮素營養(yǎng)和土壤中化合態(tài)氮大量增加［1－2］，對于自然界氮素的生物循環(huán)和農(nóng)林生產(chǎn)都有十分重要的作用。花櫚木Ormosia henryi屬豆目Fabales蝶形花科Papilionaceae紅豆樹屬Ormosia，主產(chǎn)于中國亞熱帶地區(qū)，其材質(zhì)優(yōu)良，是制作高檔家具、工藝雕刻和特種裝飾品的珍貴用材樹種［3］。段如雁等［4］通過對花櫚木結(jié)瘤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當(dāng)年生花櫚木幼苗根瘤較少，幼苗生長細(xì)弱，其固氮效率很低。未結(jié)瘤的當(dāng)年生幼苗上山造林成活率低，只有到第2年時才有部分結(jié)瘤，且結(jié)瘤幼苗在生長上、生理生化特征上都優(yōu)于未結(jié)瘤幼苗 。因此，通過人工接種優(yōu)良菌株，建立一個高效的花櫚木-根瘤菌共生體系是提高苗木品質(zhì)的重要措施。通過研究花櫚木與根瘤菌之間的最佳匹配關(guān)系，推廣花櫚木根瘤菌的接種技術(shù)，使花櫚木獲得最佳生長效果，不僅可以提高花櫚木苗木品質(zhì)和造林成活率，還可以豐富豆目樹木根瘤菌在整個根瘤菌應(yīng)用研究領(lǐng)域的內(nèi)容。目前，中國對花櫚木的根瘤菌研究較少，除筆者［4］進行過初步研究外，韓素芬等［5］對花櫚木的根瘤形態(tài)、結(jié)瘤數(shù)量進行過研究，李東等［6］對花櫚木根瘤菌的16S rDNA序列進行過分析。尚未涉及到人工接種根瘤菌對花櫚木幼苗生理和生長效應(yīng)的研究。本研究擬通過對花櫚木幼苗接種不同根瘤菌試驗，測定接種不同菌株后花櫚木幼苗的光合生理指標(biāo)以及苗高、地徑、生物量、根系等生長指標(biāo)變化，以揭示不同根瘤菌株對花櫚木幼苗的促生效應(yīng)，初步篩選出高效促生的優(yōu)良根瘤菌種，為今后花櫚木育苗中人工接種根瘤菌,培育優(yōu)質(zhì)壯苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花櫚木種子采自貴州省石阡縣同一母株，千粒重為（390.6±0.4）g，凈度為94.6%。移栽基質(zhì)為經(jīng)過121℃高溫高壓滅菌0.5 h的蛭石，育苗容器為直徑20 cm高度15 cm的塑料盆，使用前用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%高錳酸鉀溶液進行消毒。

供試菌株是從貴州、浙江、安徽、福建、江西等省采集的花櫚木根瘤分離，經(jīng)加有剛果紅的酵母甘露醇瓊脂（YMA）平板上劃線，28℃恒溫培養(yǎng)，并通過16S rDNA序列分析及回接驗證篩選出20株純化菌株（表 1）。

1.2 研究方法

選取飽滿的花櫚木種子，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%升汞溶液浸泡10 min進行表面消毒，然后浸泡于80℃的熱水中，并讓其自然冷卻。種子吸脹后，置于無菌發(fā)芽盒中，在25℃培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。待芽苗長至1～2 cm時，將芽苗移栽到裝有蛭石的塑料花盆中。移栽花櫚木芽苗5株·盆－1，共移栽芽苗126盆，置于塑料大棚中培養(yǎng)，待花櫚木長出真葉后，接種不同的根瘤菌菌液，設(shè)置重復(fù)3個·處理-1，每個重復(fù)設(shè)10株苗，共21個處理（含不接種根瘤菌的對照ck）。

供試菌株在YMA斜面上活化后，接入YMA液體培養(yǎng)基中，28℃下?lián)u床培養(yǎng)3 d至對數(shù)期，用分光光度計檢測菌液吸光度D（600）為0.7時即可接種。接種菌液10 mL·株－1，接種方式為直接將菌液澆灌在苗木根部，隔15 d澆1次無氮營養(yǎng)液，不施加其他肥料，隔30 d追澆1次根瘤菌菌液，到2016年7月抽查到苗木結(jié)瘤為止。

于2016年5月下旬，花櫚木幼苗接種根瘤菌3 d后開始測量苗高、地徑，以后測量1次·月－1，直到11月底試驗結(jié)束。接種后2個月抽查苗木結(jié)瘤情況，苗木結(jié)瘤后于8月中旬晴天測定花櫚木幼苗光合生理指標(biāo)以及葉綠素?zé)晒獾戎笜?biāo)。試驗結(jié)束后，統(tǒng)計各處理的結(jié)瘤數(shù)和根瘤質(zhì)量，從各處理中選取標(biāo)準(zhǔn)株5株測定生物量以及根系狀況。

表1 通過16S rDNA序列分析及回接驗證的20株菌株Table 1 Twenty strains by return verifying and 16S rDNA sequence analysis

1.3 指標(biāo)測定方法

1.3.1 苗高、地徑及生物量測定 用卷尺測苗高（精度0.1 cm），游標(biāo)卡尺測地徑（精度0.01 mm）。生物量測定方法：選取5株標(biāo)準(zhǔn)株，將苗木洗凈擦干后放到105℃烘箱中殺青15 min，再用70℃烘（17±1）h，在干燥器中冷卻后用1/1 000電子天平稱取地上部分和地下部分干質(zhì)量，單株生物量＝地上部分干質(zhì)量＋地下部分干質(zhì)量。

1.3.2 根系指標(biāo)的測定 先將選取的花櫚木標(biāo)準(zhǔn)株沖洗干凈，用吸水紙吸干，把待測根系用根系掃描分析系統(tǒng)（WinRHIZO）進行根系指標(biāo)的分析。

1.3.3 光合參數(shù)的測定 于8月中旬的晴天上午 9：00－11：00，各處理選擇3株標(biāo)準(zhǔn)株的功能葉片，用LI-6400便攜式光合儀測定光合速率、蒸騰速率等光合指標(biāo)。測定時使用紅藍(lán)光源葉室，光照強度設(shè)置為 1 000 μmol·m－2·s－1， 二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)設(shè)為 400 μmol·mol－1， 測定時保持葉片自然生長角度不變， 對測定的數(shù)據(jù)取平均值。葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定：使用 Junior-PAM葉綠素?zé)晒鈨x測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，主要包括最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv/Fm），PSⅡ潛在活性（Fv/Fo），實際光合量子產(chǎn)量（YⅡ），光化學(xué)猝滅（qP），非光化學(xué)猝滅（qN）。進行實驗前將Junior-pam連接好。將葉片暗適應(yīng)30 min后放到磁性葉夾上進行實驗，在測量Fv/Fm前確保實時熒光（Ft）小于600，飽和脈沖、遠(yuǎn)紅光強度和持續(xù)時間選用默認(rèn)設(shè)置，光化光強度設(shè)置為 1 150 μmol·m－2·s－1， 點擊誘導(dǎo)曲線程序按扭進行自動測量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件進行分析處理。采用Duncan法進行多重比較。利用隸屬函數(shù)法對各個指標(biāo)進行綜合評價［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 對花櫚木幼苗結(jié)瘤數(shù)和鮮瘤質(zhì)量的影響

單株結(jié)瘤數(shù)和根瘤質(zhì)量是評價瘤菌結(jié)瘤效率的重要指標(biāo)。由表2可得：與對照相比，接種根瘤菌后，花櫚木幼苗結(jié)瘤率顯著（P＜0.05）增加，結(jié)瘤率均為90.0%以上。其中7號處理單株根瘤數(shù)最多，15號和17號次之，分別是ck的102.9，100.0和95.3倍，3號處理單株根瘤數(shù)最少，為ck的24.3倍。不同菌株處理后苗木單株根瘤質(zhì)量與根瘤數(shù)變化趨勢一致。

表2 接種不同根瘤菌對花櫚木單株結(jié)瘤數(shù)和單株瘤質(zhì)量的影響Table 2 Effects of inoculated different rhizobium strains on nodule number and nodule weight per plant of Ormosia henryi seedlings

2.2 對花櫚木幼苗光合速率、蒸騰速率的影響

圖1 接種不同根瘤菌對花櫚木幼苗光合速率的影響Figure 1 Effects of inoculated different rhizobium strains on photosynthetic rate of Ormosia henryi seedlings

光合速率的大小直接決定著植物光合能力的強弱。試驗結(jié)果（圖1）顯示：接種根瘤菌可以提高花櫚木幼苗的光合速率。接種不同根瘤菌的花櫚木幼苗光合速率差異顯著（P＜0.05）。與ck相比，所有接種根瘤菌處理的花櫚木幼苗葉片的光合速率都高于ck，增幅為41.6%～197.4%。接種2號、1號、9號菌株的花櫚木光合速率較高，分別比ck提高197.4%，177.9%，177.9%，說明這幾個菌株更有利于花櫚木光合能力的提高。

圖2表明：接種不同菌株對花櫚木幼苗蒸騰速率的影響差異顯著（P＜0.05）。各菌株處理的蒸騰速率變化范圍為 0.32～1.90 mmol·m－2·s－1。 蒸騰速率最高為2號菌株，是ck的6.1倍；最低為10號菌株，比ck高3.2%。蒸騰速率大于 1.00 mmol·m－2·s－1的處理有2號和3號菌株，表明這些菌株接種后有利于促進花櫚木幼苗蒸騰作用的進行。

圖2 接種不同根瘤菌對花櫚木蒸騰速率的影響Figure 2 Effects of inoculated different rhizobium strains on transpiration rate of Ormosia henryi seedlings

2.3 對花櫚木幼苗葉綠素?zé)晒獾挠绊?/h3>

表3表明：接種不同根瘤菌的花櫚木幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)差異均達到顯著水平（P＜0.05）。接種根瘤菌各處理實際光化學(xué)量子產(chǎn)量YⅡ均高于ck，增幅為4.8%～95.2%，其中，接種20號菌株YⅡ最大，是ck的2.0倍，表明其PSⅡ反應(yīng)中心有部分關(guān)閉情況下的實際原初光能捕獲效率最高。qP為光化學(xué)猝滅，反映的是PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額。接種根瘤菌各處理qP均高于ck，增幅為7.7%～51.9%，其中，接種3號菌株qP最大、8號次之，分別比對照高出51.9%和44.2%。非光化學(xué)猝滅（qN）反映的是PSⅡ天線色素吸收的光能不能用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的光能部分。qN表現(xiàn)為ck最大，接種20號菌株次之，5號菌株qN最小，分別是ck的75.0%和12.0%。Fv/Fm反映PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)稟光能轉(zhuǎn)化效率，F(xiàn)v/Fo表示PSⅡ的潛在活性，2個指標(biāo)變化趨勢基本一致，均表現(xiàn)為ck最小，接種20號菌株最大，分別是ck的2.1倍和4.8倍。

表3 接種不同根瘤菌對花櫚木葉綠素?zé)晒獾挠绊慣able 3 Effects of inoculated different rhizobium strains on chlorophyll fluorescence of Ormosia henryi seedlings

2.4 對根系生長狀況的影響

從表4可以看出：接種根瘤菌對花櫚木幼苗根系生長有明顯的促進作用，各處理間花櫚木幼苗總根表面積、根平均直徑、根尖數(shù)之間差異顯著（P＜0.05）。與ck相比，接種17號菌株的花櫚木幼苗總根表面積最大，隨后依次為7號、15號、16號菌株，但三者與接種17號菌株處理間差異不顯著（P＞0.05）。接種5號菌株總根表面積最小，僅是ck的1.4倍。1～5號菌株處理均與ck差異不顯著（P＞0.05）。接種7號、12號、11號菌株對根平均直徑的提高作用較大，分別比ck高193.3%，171.1%和171.1%，1～6號菌株對花櫚木根平均直徑的影響較小，增幅均小于50%且與ck差異不顯著（P＞0.05）。6號菌株對花櫚木幼苗根尖數(shù)的生長促進作用最大，比ck提高92.1%，與其他處理差異顯著（P＜0.05）。接種7號、4號、18號、9號、15號、17號、12號、20號、16號、13號菌株的花櫚木幼苗的根尖數(shù)增幅為37.4%～53.3%，其中7號、4號、18號增幅較大，分別為53.3%，50.0%和45.8%。

2.5 對花櫚木幼苗苗高的影響

從圖3可以看出：人工接種根瘤菌有助于促進花櫚木高生長。與ck相比，接種根瘤菌的花櫚木幼苗高生長增幅為6.3%～273.8%，差異顯著（P＜0.05）。其中，苗高增長量增幅為200%以上的菌株號為15號、4號、2號；增幅為100%～200%的菌株號為1號、13號、19號、16號、7號、6號、17號、10號、18號、14號、20號；增幅為10%～99%的菌株號為9號、12號、8號、5號、3號；11號菌株對花櫚木幼苗高生長的影響最小，僅比ck高6.3%，與ck差異不顯著（P＞0.05）。

表4 接種不同根瘤菌對花櫚木幼苗根生長的影響Table 4 Effects of inoculated different rhizobium strains on roots growth of Ormosia henryi seedlings

圖3 接種不同根瘤菌對花櫚木幼苗苗高增長量的影響Figure 3 Effects of inoculated different rhizobium strains on height growth of Ormosia henryi seedlings

2.6 對花櫚木幼苗地徑的影響

接種根瘤菌對花櫚木幼苗地徑生長有明顯促進作用（圖4）。方差分析表明：不同處理間花櫚木幼苗地徑差異顯著（P＜0.05）。接種根瘤菌的花櫚木幼苗地徑增長量比ck提高37.9%～310.3%，其中增幅為200%以上的菌株號為15號、16號、13號、2號、4號、12號；增幅為100%～200%的菌株號為17號、14號、5號、19號、8號、18號、6號、1號、7號、3號；增幅小于100%的菌株號為9號、20號、20號、11號；11號處理地徑增長量最低，僅比ck高37.9%。

圖4 接種不同根瘤菌對花櫚木幼苗地徑增長量的影響Figure 4 Effects of inoculated different rhizobium strains on ground diameter increment of Ormosia henryi seedlings

2.7 對花櫚木幼苗生物量的影響

圖5表明：接種根瘤菌的花櫚木幼苗單株生物量均高于ck，增幅為10.7%～128.6%。方差分析表明：接種不同根瘤菌的花櫚木幼苗單株生物量之間差異顯著（P＜0.05）。其中，接種13號、15號菌株單株生物量最大，比ck高了128.6%；接種6號、18號、19號、12號、16號、5號、7號、17號、1號、4號菌株花櫚木幼苗單株生物量增幅均高于100%；單株生物量增幅為50%～100%的菌株處理為9號、20號、14號、11號、8號、10號；單株生物量增幅低于50%菌株號為2號、3號菌株。

圖5 接種不同根瘤菌對花櫚木幼苗單株生物量的影響Figure 5 Effects of inoculated different rhizobium strains on biomass of Ormosia henryi seedlings

2.8 接種不同根瘤菌效應(yīng)的綜合評價

對各指標(biāo)進行相關(guān)性分析，去除相關(guān)性較強的指標(biāo)，余下地徑增長量、生物量、總根表面積、根尖數(shù)、實際光合量子產(chǎn)量、光化學(xué)猝滅、光合速率、總根瘤質(zhì)量作為隸屬函數(shù)綜合評價指標(biāo)。評價結(jié)果表明（表5）：對花櫚木幼苗生長生理促進效應(yīng)最為顯著的前5個菌株號為15號、16號、18號、7號、4號，可初步作為促進花櫚木生長的優(yōu)良菌株。

表5 接種不同根瘤菌株花櫚木幼苗質(zhì)量綜合評價Table 5 Comprehensive evaluation of quality for Ormosia henryi seedlings with different rhizobium strains

3 討論

豆目植物接種根瘤菌后光合能力顯著提高［8－12］，其主要原因是：①與根瘤菌共生形成根瘤進行生物固氮，固定的氮素轉(zhuǎn)化成氨基酸或酞胺后，運往植物的地上及其他部位，為地上部的生長提供合成物質(zhì)，增加了葉面積，提高了整個植株的碳固定水平 。②氮素供給提高了葉片中葉綠素的含量，影響天線色素的光吸收和光傳遞。 ③氮素供給促進類囊體中的電子傳遞體和煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADP+）以及細(xì)胞基質(zhì)中的二氧化碳同化酶（主要是1,5-二磷酸核酮糖羧酶Rubisco）等物質(zhì)的合成［13］，從而提高植物的光合能力。本研究中，花櫚木幼苗接種根瘤菌后，葉片光合速率都有不同程度提高，且接種不同菌株后花櫚木幼苗的光合速率存在顯著的差別，表明不同根瘤菌與花櫚木共生固氮效率亦有所不同， 這與前人的研究結(jié)果一致［14－15］。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)也是體現(xiàn)植物光合作用潛力的重要指標(biāo)，通過對花櫚木葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測量可以更深入了解與電子傳遞有關(guān)的光合器官能力［9］。接菌處理后，花櫚木葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)與對照相比，除qN外其余參數(shù)都有不同程度的提高，表明接種根瘤菌后，氮素營養(yǎng)得到補充，花櫚木幼苗的PSⅡ反應(yīng)中心開放度提高，更多的光能用于驅(qū)動電子傳遞，PSⅡ的光量子效率潛能提高，對花櫚木光合作用更為有利。本研究中無論接種哪個菌株，qN都比對照低，其原因可能是未接菌處理不能通過生物固氮為幼苗提供氮素營養(yǎng)，屬于低氮脅迫狀態(tài)，因此PSⅡ天線色素吸收的光能更多部分不能用于光合電子傳遞，只能以熱形式耗散掉。

根系是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官，接種根瘤菌促進了根系生長和根系對養(yǎng)分及水分的吸收利用。郝鳳等［16］研究結(jié)果表明：接種中華根瘤菌Sinorhizobium meliloti和不接菌相比，紫花苜蓿Medicago sativa的根長、根表面積、根平均直徑和根體積均表現(xiàn)為接菌比不接菌要好，本研究亦得到類似的研究結(jié)果。另一方面，地上部分所產(chǎn)生的光合產(chǎn)物向地下部分運輸，為根系的生長提供能量和碳架，生長點便成為很強的光合產(chǎn)物競爭部位，間接體現(xiàn)在根尖數(shù)的增加上。根尖數(shù)增加越高的處理，其光合產(chǎn)物供給能力越強。接種根瘤菌從地上部分提高光合能力，地下部分改善水分、養(yǎng)分的吸收，最終體現(xiàn)為苗高、地徑和生物量的增加。

花櫚木與根瘤菌的共生作用，是在長期的進化中相互作用、互相選擇的結(jié)果，也是與環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)果。本研究表明：在相同的條件下，花櫚木幼苗分別接種20株不同的根瘤菌菌株，雖然都可與花櫚木共生結(jié)瘤固氮，但并未獲得同樣的接種效果，說明根瘤菌和寄主之間的共生匹配關(guān)系存在差異。只有選擇合適的菌株，在共生固氮中綜合考慮宿主菌株和環(huán)境的相互關(guān)系，才有利于充分發(fā)揮共生固氮的作用，促進苗木的生長。本研究所采集的根瘤菌來自不同的區(qū)域，各自有其適生環(huán)境，雖然寄主都是花櫚木，但不同區(qū)域的的花櫚木還存在基因型上的差異，因而在相同條件下接種產(chǎn)生的效果不一致。因此，篩選最佳花櫚木與根瘤菌共生固氮體系，不僅要適地適菌，還要做到適苗適菌。此外，本研究對象為1年生花櫚木苗木，且育苗基質(zhì)并非土壤，根瘤菌與花櫚木苗木的共生環(huán)境比較單一，因此，所篩選的促生菌株對于多年生花櫚木是否具有的促進效應(yīng)，以及所篩選的優(yōu)良菌株在土壤基質(zhì)中是否有相同的促生效應(yīng)，有待進一步驗證。