張 瑋， 李會(huì)榮， 宮玲玲

（山東省飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南 250022）

硫酸黏桿菌素又名硫酸黏菌素、克利斯汀、多粘菌素E、抗敵素等，屬多肽類抗生素，對(duì)革蘭氏陰性桿菌具有較強(qiáng)的抗菌作用 （程古月等，2017）。硫酸黏桿菌素主要經(jīng)過腎臟代謝，且血藥濃度與腎功能關(guān)系密切，持續(xù)大劑量使用可導(dǎo)致藥物在腦、腎和肝等器官中蓄積，一旦藥物與組織的結(jié)合達(dá)到或接近飽和，即會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生毒性反應(yīng)（楊海峰等，2007）。我國農(nóng)業(yè)部第2428號(hào)公告規(guī)定，自2017年4月30日起，停止硫酸黏桿菌素用于動(dòng)物促生長。硫酸黏桿菌素是一種至少含有30多種不同成分的混和物，主要成分為硫酸黏桿菌素A和硫酸黏桿菌素B，占77%以上。由于硫酸黏桿菌素的紫外吸收很弱，且為末端吸收，因而需要通過柱前衍生-熒光檢測(cè)器來提高檢測(cè)的靈敏度（吳水華等，2014）。采用柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定飼料中的硫酸黏桿菌素鮮見報(bào)道。因此，本研究建立的柱前衍生化高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定硫酸黏桿菌素，可加強(qiáng)監(jiān)管部門對(duì)混合型飼料添加劑中硫酸黏桿菌素的監(jiān)督檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 分析純草酸、甲酸、碳酸鈉、鹽酸甲胺、色譜純乙腈、甲醇、丹磺酰氯。

1.1.2 儀器和設(shè)備 分析天平 （感量0.1 mg）；Agilent 1260液相色譜儀 （具有熒光檢測(cè)器）；離心機(jī)（Thermo G16）；Agilent固相萃取裝置。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 硫酸黏桿菌素A含量44.6%，B含量 33.2%（《歐洲藥典》）。

1.1.3.1 硫酸黏桿菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液 精密稱取硫酸黏桿菌素對(duì)照品0.02242 g，置于10 mL容量瓶中，用乙腈-0.2%甲酸水（V/V，2∶8）溶液定容，配成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，硫酸黏桿菌素A濃度為1.00 mg/mL，硫酸黏桿菌素B濃度為0.744 mg/mL，2～8℃冷藏保存，有效期為6個(gè)月。

1.1.3.2 硫酸黏桿菌素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液 準(zhǔn)確移取硫酸黏桿菌素準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，用20%乙腈甲酸水溶液定容至刻度。硫酸黏桿菌素A濃度為100μg/mL，硫酸黏桿菌素B濃度為74.4μg/mL，2～8℃冷藏保存，有效期為3個(gè)月。

1.1.3.3 硫酸黏桿菌素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 準(zhǔn)確移取硫酸黏桿菌素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適量，用20%乙腈甲酸水溶液稀釋成硫酸黏桿菌素A濃度分別為0.10、0.20、0.40、2.00、4.00、20.0、40.0 μg/mL；硫酸黏桿菌 素 B 濃 度 分 別 為 0.0744、0.149、0.298、1.49、2.98、14.9、29.8 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜條件的確定

1.2.1.1 檢測(cè)波長的選擇 使用熒光檢測(cè)器-反相高效液相色譜法測(cè)定硫酸黏桿菌素，在方法研制過程中，通過熒光光譜掃描來確定最佳波長。在波長200～600 nm時(shí)，硫酸黏桿菌素A和B衍生物在激發(fā)波長為344 nm，發(fā)射波長為518 nm時(shí)有最大吸收峰。熒光譜圖見圖1、圖2。

圖1 硫酸黏桿菌素A熒光掃描光譜圖

圖2 硫酸黏桿菌素B熒光掃描光譜圖

1.2.1.2 色譜柱的選擇 實(shí)驗(yàn)選用了Zorbax E-clipse XDB C8色譜柱和Zorbax SB C18色譜柱對(duì)硫酸黏桿菌素A和B的衍生物進(jìn)行色譜分離，色譜圖見圖3、圖4。硫酸黏桿菌素A和B在C8柱上達(dá)到了較好的分離效果，而在C18柱上基本沒有保留。分析其原因可能是由于硫酸黏桿菌素屬于大分子多肽類，而C8柱在弱極性較強(qiáng)的一側(cè)，更適合分析蛋白等大分子類的物質(zhì)。

圖3 C18色譜柱對(duì)硫酸黏桿菌素的分離效果

圖4 C8色譜柱對(duì)硫酸黏桿菌素的分離效果

1.2.1.3 流動(dòng)相的選擇 硫酸黏桿菌素在酸性溶液中穩(wěn)定（Orwa等，2002），故流動(dòng)相應(yīng)采用適當(dāng)?shù)乃嵝跃彌_溶液體系。實(shí)驗(yàn)分別選取了乙腈-0.2%冰乙酸水溶液和甲醇-0.2%冰乙酸水溶液作為流動(dòng)相，在乙腈-0.2%冰乙酸水溶液作為流動(dòng)相條件下，硫酸黏桿菌素的峰型對(duì)稱性差、靈敏度下降；流動(dòng)相為甲醇-0.2%冰乙酸水溶液時(shí)，硫酸黏桿菌素A和B達(dá)到較好的分離。

通過對(duì)色譜條件的優(yōu)化，最終確定為：色譜柱：C8柱長 150 mm，內(nèi)徑 4.6 mm，粒徑 5 μm，或其他效果等同的C8柱；柱溫：45℃；激發(fā)波長為344 nm，發(fā)射波長為518nm；流動(dòng)相：甲醇-0.2%冰乙酸水溶液（86∶14）；流速：1.0 m L/min；進(jìn)樣量：50 μL。

1.2.2 試樣提取條件的確定 硫酸黏桿菌素易溶于水，微溶于有機(jī)溶劑，而且多肽類抗生素在酸性條件下穩(wěn)定，多采用酸性水溶液或酸性有機(jī)溶劑來提取，根據(jù)國標(biāo)方法 （中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2014）和相關(guān)文獻(xiàn)（李延山，2017；羅方方，2013），選擇 4%三氯乙酸-4%乙酸鉛（1∶1）、甲醇-0.1%甲酸水（2∶5）和5%草酸溶液作為提取試劑進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相同的空白飼料原料做添加回收，用5%草酸溶液作為提取液時(shí)，回收率最高，而且與其他雜質(zhì)得到了更好的分離。不同提取液的提取效果見表1。用渦旋振蕩和超聲分別提取10、15、20 min和30 min進(jìn)行了比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：振蕩提取比超聲波提取的回收率略高。振蕩10 min和15 min回收率基本相同，為了節(jié)約時(shí)間，選用渦旋振蕩提取10 min。

最終確定的提取步驟為：稱取試樣2 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入15 mL 5%草酸溶液，渦旋振蕩10 min，于離心機(jī)離心5 min，上清液備用。

表1 不同提取液提取結(jié)果比較

1.2.3 SPE凈化條件的確定 根據(jù)硫酸黏桿菌素的理化性質(zhì)和極性 （宋凱等，2013；林維宣等，2009）選擇了HLB固相萃取凈化柱。洗脫溶液的溶劑強(qiáng)度要適中才能將分析物最大程度洗脫下來，因此選擇不同比例的乙腈+0.2%甲酸水、甲醇+0.2%甲酸水作為洗脫液，選擇一種空白飼料原料做添加回收實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙腈的洗脫效果明顯好于甲醇，而乙腈的比例為20%時(shí)可達(dá)到完全洗脫，回收率高，雜質(zhì)干擾較小。

最終確定的凈化條件為：固相萃取小柱用3 mL甲醇、3 mL 0.2%甲酸水活化。將提取溶液過柱（流速＜1 mL/min），用 3 mL0.2%甲酸水淋洗，用3 mL乙腈-0.2%甲酸水（2∶8）洗脫，收集洗脫液。

1.2.4 衍生化條件的確定 目前，常用于胺類和氨基酸檢測(cè)的熒光衍生試劑主要有氯甲酸芴基甲酯、鄰苯二甲醛、丹磺酰氯等。鄰苯二甲醛需要嚴(yán)格控制衍生時(shí)間和進(jìn)樣時(shí)間，且衍生產(chǎn)物很不穩(wěn)定；而丹磺酰氯則具有衍生操作簡單、衍生物穩(wěn)定性好、熒光吸收強(qiáng)、靈敏度高、基體干擾不明顯等優(yōu)點(diǎn)（LEGUA等，1999）。所以，選擇丹磺酰氯作為硫酸黏桿菌素檢測(cè)的柱前衍生試劑。實(shí)驗(yàn)研究了丹磺酰氯的濃度、緩沖溶液的pH值、衍生反應(yīng)的溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生過程的影響，從而得出最佳衍生反應(yīng)條件（張瑋等，2017）：丹磺酰氯濃度為3 mg/mL、反應(yīng)溫度為25℃、反應(yīng)時(shí)間為40 min、緩沖體系的pH為10.5。

最終確定的衍生步驟為：準(zhǔn)確吸200μL硫酸黏桿菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液 （樣品洗脫液）、200μL pH 10.5的0.1 mol/L碳酸鈉緩沖溶液、400μL丹磺酰氯衍生劑于5.0 mL玻璃離心管中，混勻后，置于25℃水浴鍋中避光衍生40 min，立即加入20μL 20 mg/mL鹽酸甲胺溶液渦旋混合，終止反應(yīng)。衍生后的試液過膜后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液線性 準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照衍生化步驟對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行衍生，衍生后濃度分別為硫酸黏桿菌素A 0.025～10.0μg/mL、硫酸黏桿菌素B 0.0186～7.44μg/mL，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣3次，按平均值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線線性。獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性范圍，線性相關(guān)系數(shù)R2=1.000，標(biāo)準(zhǔn)線性方程見圖5。

圖5 硫酸黏桿菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性

2.2 方法線性實(shí)驗(yàn) 用飼料原料玉米淀粉空白分別做 2、4、10、20 mg/kg 和 50 mg/kg 的添加實(shí)驗(yàn)，其添加濃度和峰面積的線性見圖6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：硫酸黏桿菌素A和B的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9990。

圖6 硫酸黏桿菌素方法線性

2.3 方法檢出限和定量限實(shí)驗(yàn) 混合型飼料原料空白載體中分別添加硫酸黏桿菌素儲(chǔ)備液，使樣品中硫酸黏桿菌素A的含量分別為0.5、1.0、2.0、4.0 mg/kg，硫酸黏桿菌素B的含量分別為0.372、0.744、1.49、2.98 mg/kg， 得到相應(yīng)的色譜圖。以信噪比（S/N）為3時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度作為檢測(cè)限濃度，以信噪比（S/N）為10時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度作為定量限濃度。當(dāng)A添加濃度為1.0 mg/kg，B添加濃度為0.744 mg/kg時(shí)，S/N分別為 4.5、3.9；當(dāng)A添加濃度為2.0 mg/kg，B添加濃度為1.49 mg/kg，S/N分別為11.9、10.2，平均回收率為97.2%（n=5）、102%（n=5）。因此確定本方法硫酸黏桿菌素A的檢出限為1.0 mg/kg（B為0.744 mg/kg），硫酸黏桿菌素A的定量限為2.0 mg/kg（B為1.49 mg/kg）。1.0μg/mL硫酸黏桿菌素標(biāo)樣的圖譜見圖7。飼料原料稻殼粉空白和添加圖譜見圖8和圖9；飼料原料玉米皮空白和添加圖譜見圖10和圖11；飼料原料玉米淀粉空白和添加圖譜見圖12和圖13；飼料原料葡萄糖空白和添加圖譜見圖14和圖15；混合型飼料原料空白和添加圖譜見圖16和圖17。

圖7 1.0μg/mL硫酸黏桿菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖8 空白稻殼粉色譜圖

圖9 稻殼粉2.0 mg/kg添加圖譜

圖10 空白玉米皮色譜圖

圖11 玉米皮2.0 mg/kg添加圖譜

圖12 空白玉米淀粉色譜圖

2.4 方法準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn) 選擇幾種常用作混合型飼料添加劑的載體：飼料原料稻殼粉、飼料原料玉米皮、飼料原料玉米淀粉、飼料原料葡萄糖和混合型飼料原料（稻殼粉、玉米皮、葡萄糖、玉米淀粉、玉米芯粉、桔梗、甘草、白術(shù)、赤藥、知母、茯苓混合）作為測(cè)試對(duì)象，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。在上述飼料原料中分別加入適宜體積的硫酸黏桿菌素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，使其添加濃度均為2.0、4.0、10 mg/kg，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每種樣品同一濃度做5次平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表2、表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在添加上述3個(gè)濃度的不同載體中，其平均回收率為85.1% ～106%、重復(fù)性RSD最大的為5.52%。說明該方法有較高的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

圖13 玉米淀粉2.0 mg/kg添加圖譜

圖14 空白葡萄糖色譜圖

圖15 葡萄糖2.0 mg/kg添加圖譜

圖16 空白混合型載體色譜圖

圖17 混合型2.0 mg/kg添加圖譜

表2 不同飼料原料中添加硫酸黏桿菌素A回收率

3 結(jié)論

本研究建立的混合型飼料添加劑中硫酸黏桿菌素液相色譜檢測(cè)方法，樣品的提取、凈化和衍生步驟科學(xué)合理，易于掌握，測(cè)試數(shù)據(jù)重復(fù)性好，添加回收率均可滿足分析實(shí)驗(yàn)要求，可很好地滿足混合型飼料添加劑中硫酸黏桿菌素的測(cè)定要求。

表3 不同飼料原料中添加硫酸黏桿菌素B回收率 %

添加濃度7.44mg/kg回收率 平均值 RSD 回收率 平均值 RSD 回收率 平均值 RSD稻殼粉 92.2 96.8 88.2 89.4 98.4 88.7 88.8 91.1 3.10 97.8 97.3 0.84 83.9 87.4 2.50 89.6 97.1 89.4 95.6 96.3 86.9玉米皮 110 97.0 93.5 112 97.2 91.4 108 108 3.17 89.6 94.9 3.97 88.7 90.1 2.48 103 98.4 88.4 109 92.2 88.6玉米淀粉 86.6 111 92.3 92.9 99.9 85.8 88.8 92.3 5.52 109 92.3 4.20 86.1 89.5 4.54 99.9 104 95.1 93.5 106 88.4葡萄糖 94.9 91.7 83.4 97.7 82.7 83.9 89.0 95.2 4.35 89.5 87.7 5.40 87.0 85.1 2.69 100 82.4 88.2 95.0 92.0 83.2混合型 103 84.9 87.5 98.4 87.4 84.9 103 102 1.96 84.4 86.1 1.63 88.5 88.1 3.82 102 87.2 93.6 102 86.6 86.0飼料原料類型添加濃度1.49mg/kg 添加濃度2.98mg/kg

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