白羽祥，楊煥文，徐照麗，吳 濤，易建華，王 戈，*

(1．云南農業(yè)大學煙草學院，云南昆明650201;2．云南省煙草農業(yè)科學研究院，云南昆明650021;3．云南中煙工業(yè)有限責任公司，云南昆明650224;4．廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西南寧530001)

長期連作會帶來忌連作作物生長發(fā)育進程受阻、病害和蟲害發(fā)生嚴重、產質量下降等一系列問題［1－2］?？緹熓堑湫偷募蛇B作作物，長期連作會嚴重影響煙葉生長發(fā)育及產質量形成［3］。雖然業(yè)界一直提倡輪作，但由于耕地面積逐年減少，加上利益驅使，我國烤煙連作現象依然普遍，嚴重制約了煙草行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［4］。

已有研究表明，連作導致土壤質量趨劣［5］。隨著連作年限增加，土壤養(yǎng)分失衡［6－7］，酶活性變化［8－10］，微生物數量及多樣性降低［11］，自毒物質積累［12］，多因素相互作用對土壤環(huán)境產生不利影響，進而導致植株生長發(fā)育受抑。近年來，土壤中有毒物質積累在連作中的作用機理倍受重視，其中，酚酸類物質在土壤中的積累被認為是導致連作障礙的重要因素之一［13－14］。酚酸物質廣泛分布于土壤中，具有十分重要的生理和生態(tài)功能［15－18］。對水稻、大豆、花生、黃瓜、中藥材，以及林木等的研究發(fā)現，連作土壤中酚酸物質的含量數倍于輪作，且隨連作年限增加呈明顯積累過程［19－21］。相對其他作物，連作植煙土壤中酚酸物質的動態(tài)變化研究較少?？挛妮x［22］研究發(fā)現，在煙草根際土壤水浸提液中存在著化感自毒物質，這種物質隨著種植茬次的延長有富集效應，但未明確浸提液中哪種物質起到了化感作用。符建國等［23］研究發(fā)現，連作與輪作植煙土壤根際土壤酸性有機組分種類、數量、化學成分存在差異，且連作植煙土壤中酸性物質含量較高。但陳冬梅等［24－25］發(fā)現，雖然土壤浸提液中存在自毒物質，但煙草連作后根際土壤酸類物質種類卻顯著減少。因此，有必要進一步明確連作植煙土壤中酚酸類物質種類、含量的變化趨勢，以及酚酸類物質在植煙土壤中的可能作用機制。

土壤各因子的相互作用，共同影響土壤質量［26］，進入土壤的酚酸類物質也必將參與土壤中的各種物質和能量代謝。酚酸類物質如何影響土壤環(huán)境中的其他因子，其相互作用關系如何等尚待探究，這對豐富酚酸類物質在連作問題中的作用機理認知具有積極意義［27－29］。由于酚酸類物質與土壤酶活性和理化性狀之間可能具有復雜的關系，雙變量相關性分析未必能反映兩個變量間的真實關系，因此，本研究在相關性分析的基礎上，利用SPSS 19.0軟件中的逐步回歸模型進行分析，研究了不同連作年限下植煙土壤中酚酸類物質與土壤理化性狀、酶活性的關系，以便篩選出真正具有影響的變量，即影響因素［30］，旨在為探明酚酸類物質在連作問題中的作用機理提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1．1 連作植煙土壤樣品采集

于2017年在云南省保山市施甸縣姚關鎮(zhèn)陡坡村連片烤煙種植示范區(qū)采集土樣，該區(qū)域土地由同一農戶承包，土壤質地為砂壤土，種植烤煙品種為K326，前茬作物為大麥。每年烤煙施氮量(N)為 120 kg·hm－2，施磷量(P2O5)為 90 kg·hm－2，施鉀量(K2O)為321 kg·hm－2，肥料由當地煙草公司提供。栽培管理措施統一按照當地優(yōu)質煙葉生產技術進行。

每年植煙之前，利用五點取樣法采取第1年(T1，對照)、第6年(T6)、第 8年(T8)、第 14年(T14)和第16年(T16)種植烤煙的0～20 cm土樣，每一處理采取2 kg。

1．2 土壤樣品處理及方法

各處理稱取100.00 g新鮮樣品置于離心管中(3 次重復)，加入100 mL 1 mol·L－1NaOH 放置24 h，振蕩60 min，離心后將濾液用12 mol·L－1的 HCl酸化至pH 2.5，120 min后離心除去胡敏酸，然后將上清液過0.22 μm的纖維膜，濾液用高效液相色譜(HPLC)測定，結果按照烘干土質量換算。

1．3 測定項目和測定方法

土壤理化性狀測定項目包括pH、有機質、全N、全P、全K、堿解N、有效P、速效K，分別參照行業(yè)標準 NY/T 1377—2007、NY/T 1121.6—2006、NY/T 53—1987、NY/T 88—1988、NY/T 87—1988、LY/T 1229—1999、NY/T 1121.7—2006、NY/T 889—2004進行測定。

酶活性依據梅守榮［31］的方法進行測定。土壤過氧化氫酶(CAT)活性采用KMnO4滴定法測定;脲酶活性利用靛酚藍比色法測定;蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定;酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定。

土壤酚酸類化合物的測定采用HPLC進行。儀器為Aglient 1200高效液相色譜儀，色譜柱為SunFireTMC18 柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流速1 mL·min－1，柱溫 25oC，檢測波長 280 nm。流動相A(甲醇)和流動相B(pH值2.5的乙酸水溶液)的梯度如下:0 min，流動相A 30%，流動相B 70%;15 min，流動相A 50%，流動相B 50%;16 min，流動相A 70%，流動相B 30%;30 min，流動相A 0，流動相B 100%。標準樣品分別為闊馬酸、對羥基苯甲酸、間苯三酚、香草酸、香蘭素、阿魏酸、鄰苯二甲酸、苯甲酸、肉桂酸和水楊酸，進樣量10 μL。每個周期分析結束后，等待10 min，以便去除干擾成分的影響，保證分析結果的穩(wěn)定性和重復性。

1．4 數據處理

實驗數據采用Microsoft Office 2013進行初步處理，采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，利用Duncan's新復極差法進行多重比較，并在相關性分析的基礎上利用逐步回歸模型對各項數據進行分析。

2 結果與分析

2．1 連作對植煙土壤理化性狀的影響

從表1可以看出:隨著連作年限增加，植煙土壤pH值、有機質和全氮含量降低，速效鉀含量隨連作年限延長而表現出升高趨勢，連作第14年和第16年的土壤速效鉀含量顯著(P＜0.05)高于其他處理;全磷、全鉀、堿解氮和有效磷含量隨連作年限延長呈現出先降低后升高的趨勢，最低值分別出現在第6年、第8年、第14年和第14年。以上結果表明，連作導致植煙土壤酸化，各養(yǎng)分發(fā)生非均衡變化。

2．2 連作對植煙土壤酶活性的影響

從表2可以看出，隨著連作年限延長，植煙土壤中過氧化氫酶、脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶活性均呈現出先升高后降低的趨勢，但不同酶活性的峰值出現在不同年限，其中，第8年的過氧化氫酶和酸性磷酸酶活性顯著(P＜0.05)高于其他年限，第6年的脲酶活性顯著(P＜0.05)高于其他年限，第6年和第8年的蔗糖酶活性顯著(P＜0.05)高于其他年限。

2．3 連作對植煙土壤酚酸類物質的影響

從表3可以看出，在植煙土壤中檢出了8種酚酸類物質，分別為間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸。其中，間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸和總量整體表現出隨著連作年限延長而升高的趨勢，且均以第16年最高，顯著(P＜0.05)高于其他處理。苯甲酸和肉桂酸含量則呈先升高后降低趨勢。

表1 連作對植煙土壤理化性狀的影響Table 1 Effect of continuous cropping on soil physiochemical properties in tobacco-planted soil

表2 連作對植煙土壤酶活性的影響Table 2 Effect of continuous cropping on soil enzymes activities in tobacco-planted soil

表3 不同連作年限植煙土壤酚酸類物質種類和含量Table 3 Species and contents of phenolic acids in tobacco-planted soil mg·kg －1

2．4 酚酸類物質與土壤酶活性、理化性狀的相關性分析

從表4可以看出，酚酸類物質含量與土壤酶活性、理化性狀具有不同程度的相關性。土壤過氧化氫酶與對羥基苯甲酸呈顯著負相關(P＜0.05)，與肉桂酸呈極顯著正相關(P＜0.01)。脲酶與間苯三酚、闊馬酸、阿魏酸、酚酸總量呈顯著負相關(P＜0.05)。土壤pH值與間苯三酚含量呈顯著負相關(P＜0.05)。

2．5 酚酸類物質與土壤酶活性、理化性狀的相互影響

逐步回歸分析得出的偏回歸方程的標準化系數代表了對應自變量的影響力，標準化系數的正負分別代表了該自變量對因變量所起到的促進或抑制作用［30］。

由表5可以看出，以酚酸類物質為自變量，土壤酶活性和理化性狀為因變量，通過逐步回歸分析剔除無關變量后，擬合出pH與間苯三酚、過氧化氫酶與肉桂酸、脲酶與闊馬酸的回歸方程，說明除間苯三酚影響pH、肉桂酸影響過氧化氫酶、闊馬酸影響脲酶外，其余酚酸類物質對土壤其他酶活性和理化性狀無顯著影響。從標準化系數上來看，間苯三酚對pH有抑制作用，肉桂酸對過氧化氫酶活性有促進作用，闊馬酸對脲酶活性有抑制作用。

表4 酚酸類化合物與土壤酶活性、化學性狀相關性分析Table 4 Correlation analysis of phenolic compounds and soil enzymes activities and physiochemical properties

表5 酚酸類物質與土壤酶活性、理化性狀的逐步回歸分析Table 5 Stepwise regression analysis of phenolic acids and soil enzymes activities and physiochemical properties

由表6可以看出，以酚酸類物質為因變量，以酶活性為自變量，通過逐步回歸分析剔除無關變量后，擬合出間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和酚酸類物質總量的回歸方程，說明除香草酸、香蘭素和苯甲酸外，酶活性對酚酸類物質有一定的影響。從標準化系數上來看，間苯三酚、闊馬酸和酚酸類物質總量受脲酶的抑制作用，對羥基苯甲酸和肉桂酸分別受過氧化氫酶的抑制和促進作用，阿魏酸分別受脲酶和過氧化氫酶的抑制作用、蔗糖酶的促進作用，且以脲酶的影響最大、蔗糖酶次之、過氧化氫酶最小。

由表7可以看出，以化學性狀為自變量，酚酸類物質為因變量，通過逐步回歸分析剔除無關變量后，擬合出間苯三酚、對羥基苯甲酸和酚酸類物質總量與pH的回歸方程，說明pH對這3種酚酸有影響，其他土壤理化性狀對其他酚酸類物質無顯著影響。從回歸方程的標準化系數來看，pH對間苯三酚、對羥基苯甲酸和酚酸類物質總量均有具有抑制作用。

表6 酶活性與酚酸類物質的逐步回歸分析Table 6 Stepwise regression analysis of enzymes activities and phenolic compounds

表7 土壤理化性狀與酚酸類物質的逐步回歸分析Table 7 Stepwise regression analysis of soil physiochemical properties and phenolic compounds

3 結論與討論

本研究將酚酸類物質作為土壤環(huán)境中的重要組分，初步明確了其與土壤中其他主要環(huán)境因子(理化性狀和酶活性)的相互關系，并在此基礎上利用逐步回歸分析進一步探討酚酸類物質與土壤酶活性、理化性狀的相互關系，研究結果進一步明確了酚酸類物質在連作土壤中的積累特征以及與土壤主要因子的關系，對今后深入開展酚酸類物質與環(huán)境因子的相互作用研究提供了一定的理論依據。

前人對茄子［13］、大豆［14］、蘋果［32］和草莓［33］的連作研究表明，酚酸類物質在連作土壤中積累并在某種程度上導致了連作障礙的發(fā)生。植株通過根系向周圍土壤環(huán)境分泌酸類物質是土壤中酚酸類物質的主要來源之一，隨著烤煙連作年限增加，酚酸物質逐漸積累并參與土壤各種生理生化過程［34］。本實驗在前人研究的基礎上，利用高效液相色譜在不同連作年限的植煙土壤中檢測出了8種酚酸類物質，分別為間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、香草酸、香蘭素、阿魏酸、苯甲酸和肉桂酸，其中，間苯三酚、闊馬酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、阿魏酸、香蘭素的含量和酚酸類物質總含量均隨著連作年限的延長而表現出升高的趨勢，說明隨著連作年限延長，酚酸類物質在土壤中表現出富集效應。

業(yè)已證明，連作對土壤酶活性和土壤養(yǎng)分具有重要影響［35－38］，本研究也得到相似結論:隨著連作年限延長，過氧化氫酶、脲酸、酸性磷酸酶、蔗糖酶活性的變化趨勢均表現為先升高后降低，且酶活性峰值出現在不同年限;土壤中pH值、有機質和全N含量均不同程度下降，有效K含量增加，全磷、全鉀、堿解氮和有效磷隨著連作年限延長呈現出先降低后升高的趨勢。總體而言，連作導致植煙土壤酸化和養(yǎng)分失衡。

受研究方法和手段的限制，前人相關研究大多以描述性為主，并未對連作土壤理化性狀、酶活性與酚酸類物質的相互作用機制及相互影響進行探討［22－23］。本研究利用相關性分析發(fā)現，土壤中酚酸類物質與酶活性、理化性狀具有相關性，并利用逐步回歸模型進一步探究了其相互影響。逐步回歸分析結果顯示，雖然土壤中酚酸類物質和酶活性具有相關性，但通過逐步回歸分析剔除無關變量后發(fā)現，酚酸類物質對酶活性的影響較小，而酶活性對酚酸類物質卻有較大的影響。這種影響可能是通過微生物的活動等某些不確定的因子相互作用產生的［19，21］。酚酸類物質除與土壤pH相關外，與土壤養(yǎng)分并無顯著相關性，逐步回歸分析進一步發(fā)現，pH對間苯三酚、對羥基苯甲酸和酚酸類物質總含量存在抑制作用，即pH越低，酚酸類物質積累越明顯，這在一定程度上說明連作導致植煙土壤酸化是使酚酸類物質積累的一個因子，因此，可通過調節(jié)土壤pH值來緩解植煙土壤中酚酸類物質的積累，從而緩解連作帶來的一系列問題。這與李亮亮等［30］對酚酸類物質在土壤中降解的研究結果一致。酚酸類物質與土壤理化性狀的逐步回歸分析還顯示，除間苯三酚對pH有影響外，其余酚酸類物質對其他土壤理化性狀指標并無直接影響?？紤]到酚酸類物質與酶活性的互相影響，可以認為酚酸類物質會通過影響酶活性等因素來對植煙土壤理化性狀間接產生影響，從而進一步加劇連作土壤的養(yǎng)分失衡。本文結果從統計分析的角度初步闡述了酚酸類物質與酶活性、理化性狀的相互影響。在此基礎上，可通過外源添加酚酸等方式來進一步驗證其對土壤各環(huán)境因子的影響，從而進一步明確酚酸類物質在連作植煙土壤中的作用機制。