李文婷，段醒妹，夏厚林*

腫瘤是當(dāng)今世界上的共同醫(yī)學(xué)問題，腫瘤嚴(yán)重影響著人類的健康[1]，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展與進(jìn)步，腫瘤的治療已經(jīng)由傳統(tǒng)的化療及手術(shù)外科治療轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N新型治療方法，其中基因治療在腫瘤治療中顯示出其獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)。RNA干擾是基因治療中常用的技術(shù)手段，是指內(nèi)源性或者外源性與靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)特異地降解該mRNA，從而致使特異性的基因有效封閉的過程[2]。而裸siRNA在生物體內(nèi)容易被核酶降解，轉(zhuǎn)染效率低，因此需要尋求安全的基因載體來實(shí)現(xiàn)基因藥物的有效遞送。本實(shí)驗(yàn)制備得到納米粒載體，并對(duì)其粒徑和電位進(jìn)行了測(cè)定，通過陽離子膠束遞送Bcl-xl siRNA遞送至C26細(xì)胞中，抑制Bcl-xl 基因的表達(dá)，從而引發(fā)C26細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步達(dá)到抑制C26細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。

1 材料

1.1 材料

C26細(xì)胞（美國(guó) ACTT；Bcl-xl siRNA（上海吉瑪基因）；（2，3-二油?；?丙基）-三甲胺（DOTAP）(美國(guó)Avanti)；聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（MPEG-PCL）；細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone）；胎牛血清(美國(guó) Hyclone)；FAM siRNA(上海吉瑪)；MTT、二甲基亞砜（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；Trizol RNA分離試劑（美國(guó)invitrogen公司）；二氯甲烷，三氯甲烷，乙酸乙酯、氯仿、異丙醇、95%乙醇（成都科龍?jiān)噭?%多聚甲醛（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司）；結(jié)晶紫染液（美國(guó)Amresco）；細(xì)胞凋亡試劑盒（南京凱基生物公司）；PCR試劑盒(Prime ScriptTM Kit reagent Kit with gDNA Eraser)

1.2 儀器

JA1003電子天平（上海順宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；EYELAN-1200A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社）；EYELA-CCA-1111低溫冷卻液循環(huán)泵（東京理化器械株式會(huì)社）；ZEN-3600激光粒度儀（英國(guó)Malvern）；DZF-6090真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；紫外檢測(cè)儀（美國(guó)Bio-RAD）；低速離心機(jī)（上海賽默飛世爾儀器有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD Biosciences）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（上海賽默飛世爾儀器有限公司）；CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海賽默飛世爾儀器有限公司）；Q-PCR儀（加拿大Applied Biosystem）

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 納米粒DMP的制備 稱取20 mg DOTAP和40mgMPEG-PCL，溶于4 mL的二氯甲烷，轉(zhuǎn)移至梨形瓶中，在55℃水浴條件下1小時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)形成一層薄膜，加入5 mL的超純水，在55℃條件下水浴15分鐘，用超純水定容至5 mL制備得到12 mg﹒mL-1的納米粒DMP，置于4℃條件下保存。

2.1.2 納米粒DMP的表征 對(duì)制備的陽離子膠束采用馬爾文激光粒度儀中進(jìn)行粒徑和zeta電位的測(cè)定。吸取20 μl DMP溶液，用1 mL超純水稀釋100倍后放入設(shè)置溫度為25℃，平衡時(shí)間為2分鐘，所有結(jié)果測(cè)定3次。

2.1.3 納米粒DMP的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將C26細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1.2×104個(gè)細(xì)胞，且每孔添加100μL含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基。24中小時(shí)后，將100 μL濃度為0.1，0.15，0.2，0.3，0.4，0.6，0.8，1.2 μg﹒mL-1的DMP膠束及PEI25K加入相應(yīng)的孔中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加入20μLMTT溶液（5 mg﹒mL-1），繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后小心倒掉上清液，每孔加入150 μL DMSO，搖床低速震蕩10分鐘使結(jié)晶完全溶解。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度A。采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)處理計(jì)算出半數(shù)抑制率（IC50）。

2.1.4 體外基因沉默表達(dá)檢測(cè)試驗(yàn)（Quantitative Realtime PCR,Q-PCR） Bcl-xl siRNA靶序列：5′- AAG GAU ACA GCU GGA GUC AGU-3′；以Scramble siRNA靶序列：5′-AAU UCU CCG AAC GUG UCA CGU-3′為陰性對(duì)照siRNA。將C26細(xì)胞接種于6孔板中，每孔13×104個(gè)細(xì)胞，且每孔添加2mL含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基。24小時(shí)后，用等量無血清DMEM培養(yǎng)基清洗并替換。依次加入制備的DMP、DMP/Scramble siRNA、DMP/siBclxl繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，以加等量培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。用TRIzol? Reagent提取C26細(xì)胞中總RNA，并用SuperScript II逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定法（Invitrogen）合成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR用SYBR GreenER定量PCR SuperMix Universal試劑盒（Invitrogen）進(jìn)行。在AB7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上用標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)程序進(jìn)行反應(yīng)：50℃2分鐘，95℃10分鐘，40個(gè)循環(huán)的95℃15秒和60℃1分鐘Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA）。用于檢測(cè)小鼠Bcl-x1（正向; 5"-TCG GGA TGG AGT AAA CTG GG-3"，反向; 5"-CCA CGC ACA GTG CCC C-3"），和GAPDH（正向; 5"-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3" -TAA AAG CAG CCC TGG TGA CC-3"）。

2.1.5 納米粒DMP傳輸Bcl-xl siRNA的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn) 將C26細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1.2×104個(gè)細(xì)胞，且每孔添加100 μL含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基。24小時(shí)后，將100 μL的不同濃度的DMP/siBcl-xl加入相應(yīng)的孔中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后小心倒掉上清液，每孔加入150μLDMSO，搖床低速震蕩10分鐘使結(jié)晶完全溶解。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組。利用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度A，并按照以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.1.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的C26細(xì)胞接種到6孔板中，使每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)為1000個(gè)，并添加2 mL完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)向孔中分別加入DMP、DMP/Scramble siRNA、DMP/siBcl-xl(50nM)、DMP/siBcl-xl(100nM)、DMP/siBcl-xl(200nM)后繼續(xù)培養(yǎng)1-2周，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，3-4天小心換液，以加等量培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。待細(xì)胞生長(zhǎng)至肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心漂洗。每孔加入適量4%多聚甲醛固定液固定細(xì)胞10分鐘左右。棄固定液，加入結(jié)晶紫染液染色10-15分鐘，用流動(dòng)的水緩慢小心沖洗去染液，在空氣中晾干，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率。

2.1.7 納米粒傳輸Bcl-xl siRNA的抗腫瘤細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的C26細(xì)胞接種于24孔板中，每孔加入500 μL含5×104個(gè)細(xì)胞的包含10%FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基。24小時(shí)后，用等量無血清DMEM培養(yǎng)基清洗并替換。依次加入制備的DMP、DMP/Scramble siRNA、DMP/siBcl-xl轉(zhuǎn)染72小時(shí)，以加等量培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞用不含EDTA的胰蛋白酶消化吸收并用PBS洗滌細(xì)胞（2000 rpm離心5分鐘后棄上清液）后用加入預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜。次日1500 r﹒min-1離心5分鐘棄固定液，用預(yù)冷PBS洗2遍。每個(gè)流式管加入200 μLPI染液震蕩均勻，避光染色30分鐘。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 納米粒DMP的表征 制備所得的納米粒DMP呈均勻的半透明的狀態(tài)，平均粒徑為144.8 nm，可完全分散在水溶液中，多分散系數(shù)PDI為0.183， zeta電位為46.4mV。粒徑和zeta電位結(jié)果如圖所示。

2.2.2 納米粒DMP的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 陽離子膠束的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)用MTT法在293T細(xì)胞中進(jìn)行測(cè)定。如圖所示，PEI25K在293T細(xì)胞中表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性，其IC50為0.83 μg﹒mL-1而陽離子膠束DMP的IC50為3.7 μg﹒mL-1，相比PEI25K，具有較低的細(xì)胞毒性。因此，陽離子膠束DMP比PEI25K的細(xì)胞毒性更低，能夠作為一種安全的納米傳輸siRNA。

圖1 DMP膠束的粒徑分布

圖2 DMP的zeta電位

圖3 DMP在293T細(xì)胞中的細(xì)胞毒性

2.2.3體外基因沉默表達(dá)檢測(cè)（Q-PCR）結(jié)果

C26細(xì)胞中Bcl-xl的mRNA 在siRNA干擾后的含量如圖所示。通過Q-PCR的結(jié)果顯示，與空白組與DMP/Scramble siRNA 組相比，DMP/siBcl-xl組有效地降低了Bcl-xl信使RNA的水平。說明DMP能夠?qū)iRNA有效地導(dǎo)入并沉默Bcl-xl基因的表達(dá)。

圖4 DMP/siBcl-xl 明顯地減少了Bcl-xl基因的mRNA 水平

2.2.4 DMP/siBcl-xl的體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn) 我們通過用DMP傳輸siRNA至C26細(xì)胞中研究DMP/siBcl-xl能夠抑制C26細(xì)胞的增殖。C26細(xì)胞的生存能力用MTT來測(cè)定，結(jié)果如圖所示。結(jié)果顯示DMP/siBcl-xl(50nM 和100nM)的生存率分別為69.6%±3.3%，56.3%±1.9%，與DMP組相比，其生存率遠(yuǎn)低于DMP組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DMP/siBcl-xl能夠有效地抑制轉(zhuǎn)染的C26細(xì)胞的生存能力，DMP組沒有明顯的減少細(xì)胞生存能力。結(jié)果表明Bcl-xl siRNA能夠抑制Bcl-xl 基因的表達(dá)并且引發(fā)相關(guān)轉(zhuǎn)錄基因的沉默，所以DMP/siBcl-xl 能夠?qū)崿F(xiàn)C26細(xì)胞的抗增殖作用。

圖5 DMP/siBcl-xl 對(duì)C26細(xì)胞的體外抗腫瘤效果

2.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 為了進(jìn)一步研究DMP/siBclxl 的抗腫瘤活性，我們進(jìn)行了克隆形成實(shí)驗(yàn)。如圖所示，從照片中可明顯看出與空白對(duì)照組相比較，DMP組與DMP/Scramble siRNA 組形成的克隆數(shù)明顯較少，而DMP/siBcl-xl組形成的克隆數(shù)則比二者更少。通過對(duì)形成的克隆數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而計(jì)算得到DMP/siBcl-xl 在50 nM,100 nM,200 nM的濃度下的抑制率分別為59.08%±6.82%, 90.90%±2.28%,98.98%±0.26%。結(jié)果顯示，五個(gè)實(shí)驗(yàn)組均抑制了C26細(xì)胞的增殖，但DMP/siBcl-xl 顯示出更強(qiáng)的抑制作用，再次證明DMP/siBcl-xl能夠抑制C26細(xì)胞的增殖，具有顯著的抗腫瘤活性。

圖6 經(jīng)不同濃度DMP/siBcl-xl轉(zhuǎn)染后的克隆形成圖片

圖7 經(jīng)不同濃度的DMP/siBcl-xl轉(zhuǎn)染后的克隆形成的抑制率

2.2.5 DMP/siBcl-xl的抗腫瘤細(xì)胞的凋亡實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證DMP/Bcl-xl siRNA引起的C26細(xì)胞增殖以及生存能力的下降是否與細(xì)胞的凋亡有關(guān)，用DMP、DMP/Scramble siRNA和DMP/siBcl-xl對(duì)C26細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，收集細(xì)胞測(cè)定凋亡細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果如圖所示，DMP組的細(xì)胞凋亡率為5.6%±0.8%，DMP/Scramble siRNA組的細(xì)胞凋亡率為11.2%±1.1%，而DMP/siBcl-xl組的細(xì)胞凋亡率為33.0%±3.8%，該結(jié)果與MTT以及克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，均證明DMP/siBcl-xl其治療的機(jī)制可能就是通過引起細(xì)胞的凋亡來抑制癌細(xì)胞的增殖與生長(zhǎng)。

圖8 DMP/siBcl-xl siRNA引起C26細(xì)胞凋亡情況

3 討論

結(jié)腸癌是一種常見的惡性腫瘤，盡管可以通過手術(shù)治療和化療來緩解病情的惡化，但接近一半的患者后期恢復(fù)情況極差，在五年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或者死亡的情況。因此，越來越多的研究致力于新型的腫瘤治療手段的發(fā)展。RNA干擾作為一種基因治療技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療中。本實(shí)驗(yàn)采用了本實(shí)驗(yàn)通過基因治療技術(shù)研究小干擾RNA分子Bcl-xl siRNA在納米粒DMP的遞送下能夠沉默Bcl-xl基因，進(jìn)而抑制Bcl-xl基因的表達(dá)，抑制C26細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)一步引發(fā)C26細(xì)胞的凋亡，表明本實(shí)驗(yàn)所制備的DMP 納米粒能夠有效地將Bcl-xl siRNA遞送至C26細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)體外抑制C26細(xì)胞生長(zhǎng)的抗腫瘤效果。Bcl-2家族是抗凋亡基因家族，目前發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族成員超過25種[3]，已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn) Bcl-2 是重要的抑凋亡蛋白[4～5]。

有學(xué)者認(rèn)為 Bcl-2 通過抗氧化劑或抑制氧自由基的產(chǎn)生而發(fā)揮其抑制細(xì)胞凋亡的功能[6]。Bcl-xl基因是Bcl-2家族中的一員，在抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，Bcl-xl不僅可以抑制細(xì)胞凋亡，而且可以抑制細(xì)胞壞死[7～10]。在課題中，我們所選用的siRNA為針對(duì)Bcl-xl設(shè)計(jì)的siRNA。所以針對(duì)Bcl-xl基因設(shè)計(jì)的siRNA是為了使Bcl-xl基因沉默不表達(dá)從而達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的目的。本實(shí)驗(yàn)中，我們制備出表面帶正電荷的陽離子納米粒，可以與帶負(fù)電荷的Bcl-xl siRNA通過靜電作用形成DMP/siBcl-xl復(fù)合物，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮出調(diào)節(jié)Bcl-xl基因表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果。本研究采用RNA干擾技術(shù)特異性沉默Bcl-xl基因，從而下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞C26內(nèi)Bcl-xl的表達(dá)，抑制C26細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)，進(jìn)一步引發(fā)C26細(xì)胞的凋亡。綜上所述，DMP/siBcl-xl在體外對(duì)C26細(xì)胞有顯著的抗腫瘤活性，為之后的體內(nèi)抗腫瘤活性的研究奠定基礎(chǔ)。