邱啟官，李 慶，許英蕾

(1.長沙生態(tài)動物園，湖南 長沙 410119 ; 2.浙江農(nóng)林大學動物科技學院，浙江 杭州 311300)

我國是瀕危野生動物大國，野生動物不僅是生態(tài)圈的一個重要部分，同時也是我們?nèi)祟惖墓餐膶氋F財富。野生動物瀕臨滅絕大致可以分成兩個因素，第一個因素是我們?nèi)祟愒诖笞匀恢械牟糠中袨樗l(fā)的直接的或間接地結(jié)果；第二個因素是野生動物自己本身的基因遺傳，疾病等問題造成的，在疾病對野生動物的危害中寄生蟲危害是其中一個主要的病因。全國各地的野生動物保護機構(gòu)、動物園等雖然為野生動物的生存提供了一定的保障,但將野生動物聚集在一個固定的區(qū)域里時,這將大大的增加寄生蟲感染或交叉感染的機率。Stephen A.Smith 認為不論野生或圈養(yǎng)猛禽都可能從捕食疾病、受傷、或者被捕食等問題使得自身或上級食物鏈直接或間接感染了某種寄生蟲致使自身或上級食物鏈動物出現(xiàn)寄生蟲病害問題。這些研究均表明，野生動物及圈養(yǎng)野生動物的健康已受到寄生蟲的嚴重威脅[1-3]。如何能夠預防寄生蟲對野生動物的侵襲，尋找一種有效的、準確的手段快速的檢測出野生動物體內(nèi)的寄生蟲，以及對患有寄生蟲的野生動物提供一種有效的治療手段，這些問題都是當代迫切需要解決的問題。

蛔蟲是寄生在動物胃腸內(nèi)的一種大型寄生線蟲，嚴重時往往引起動物腸梗阻死亡或者生長發(fā)育不良等現(xiàn)象?；紫x繁殖力強，10～20萬卵/天·蟲，每蟲一生可產(chǎn)3 000多萬個卵，蟲卵對外界各種因素的抵抗力強，易于發(fā)育成感染性蟲卵。因此，環(huán)境是蛔蟲普遍感染的重要因素。由于人類活動所造成的一系列環(huán)境、生態(tài)等問題使蛔蟲反復感染率、人獸共患機率都有所升高，這對人類健康、野生動物保護造成了威脅[4-7]。

國內(nèi)外對白獅寄生蛔蟲研究得很少，獵豹是從非洲引進的動物，在本地飼養(yǎng)已有5年，由于蛔蟲寄生宿主具有特異性，因此研究寄生于這2種野生動物的蛔蟲，有利于寄生蟲疾病的防治[8]。傳統(tǒng)的寄生蟲分類有很大局限性，隨著分子生物學的興起和PCR技術(shù)的成熟，蛔蟲的研究可以準確分類至亞種[9]。而線粒體內(nèi)細胞色素I(cox1)具有種內(nèi)保守，種間差異大的特點，被廣泛應用于寄生蟲的準確分類研究中[10]。本次樣本均采集自長沙生態(tài)動物園的白獅和獵豹，利用PCR技術(shù)，對樣品蛔蟲進行準確鑒定，并比較來自2種不同動物蛔蟲的差異性。

Blouin認為，用線粒體DNA內(nèi)的cox1 和nad4基因作為遺傳標記來鑒定蟲種，尤其是隱藏種更為有效。李明偉等應用PCR-SSCP技術(shù)和 DNA序列分析對犬弓首蛔蟲(Toxocara canis )線粒體DNA (mtDNA) 中的細胞色素C氧化酶第1亞基(cox1 ) 基因部分序列(pcox1 ) 進行了分析研究，并與弓首屬的貓弓首蛔蟲、馬來西亞弓首蛔蟲、牛弓首蛔蟲及弓蛔屬的獅弓蛔蟲進行了種間比較[11-12]。結(jié)果表明，不同犬弓首蛔蟲地方株的cox1 基因序列有一定差異，顯示較明顯的多態(tài)性；同時，線粒體基因序列分析的結(jié)果與種特異PCR鑒定結(jié)果一致。

聚合酶鏈反應-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析 (PCR-SSCP) 是20世紀90年代發(fā)展起來的一種用于檢測DNA突變的分析方法，具有簡便、快速、敏感、無假陽性、成本低等特點，適用于大量樣本的篩選，是生物醫(yī)學領域中最常用的基因突變檢測方法之一[13-14]。本研究應用PCR-SSCP方法并結(jié)合DNA序列分析對弓首蛔蟲線粒體DNA內(nèi)的cox1 基因進行多態(tài)性研究，以進一步明確該屬蟲種的分類 。

1 材料與方法

1.1 寄生蟲采集 本試驗所用蟲體樣品均采自長沙生態(tài)動物園。其中包括白獅(編號：WL1、WL2)和獵豹(編號：CH1、CH2)兩種動物蛔蟲成蟲 4個樣本，經(jīng)形態(tài)學初步鑒定為蛔蟲，70%酒精保存。

1.2 主要試劑 DNA分子量標準 DL-2000、TaqDNA 聚合酶，購自寶工生物工程(大連)有限公司；蛋白酶 K由天根生物科技(北京)有限公司生產(chǎn)；Wizard DNA Clean-up System為Promega公司產(chǎn)品。

1.3 引物 根據(jù)弓首蛔蟲線粒體內(nèi)細胞色素I(cox1 )基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計引物，引物序列為上游引物(JB3) : 5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′(24 bp)，下游引物(JB4.5): 5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′(24 bp)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.4 DNA提取 從70%酒精中用無菌鑷子取出單個蟲體，用雙蒸水反復吹洗6次，每次5 min。用滅菌微型剪刀剪取蟲體2 cm大小片段樣品至于1.5 mL的離心管內(nèi)剪碎，加入200 μL GA Buffer 溶液與30 μL蛋白酶K 溶液，反復震蕩混勻后，置于65 ℃恒溫箱內(nèi)消化2-3 h，每30 mins 混勻1次。消化完全后的蟲體懸濁液按照DNA 提取試劑盒使用說明書提取DNA，DNA 樣品分裝后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5Pcox1 基因片段的PCR 擴增與鑒定 PCR擴增體系為25 μL： 雙蒸水13.25 μL、MgCl(25 mmol/L)4 μL、dNTPs(2.5 mmol/L) 2.5 μL、10×PCR Buffer 2 μL、上、下游引物(50 pmol)各0.5 μL、rTaq(5 U/μl)0.25 mL、模板DNA 2 μL，混勻后短暫離心15 s。同時，以雙蒸水代替模版DNA 作空白對照。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；循環(huán)37次，最后72 ℃延伸5 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，并將PCR 陽性產(chǎn)物進行純化后送至華大基因生物工程技術(shù)服務有限公司測序。

2 結(jié)果分析

2.1 PCR擴增結(jié)果 2種野生動物蛔蟲成蟲4個樣品均擴增出約415 bp左右的條帶，片段大小也與所擴的片段一致，空白對照也為陰性。詳見圖1。

2.2 序列分析 兩種野生動物4個樣品測序得到的Pcox1序列，與GenBankTM收錄JF780951.1(獅弓蛔蟲)序列用Blast軟件比較，WL1與 JF780951.1比較3處堿基置換，1處堿基顛換序列差異1.0%；WL2與JF780951.1比較無序列差異，序列差異為0；CH1與 JF780951.1比較2處堿基置換，1處堿基缺失，序列差異1.0%；CH2與JF780951.1比較2處堿基置換，2處堿基缺失，序列差異 1.0%。

圖1 弓首蛔蟲pcox1 序列PCR擴增結(jié)果

2.2.1pcox1 基因序列系統(tǒng)進化分析 利用 DNAStar 5.0的MegAlign軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹顯示，在長沙生態(tài)動物園分離到的2種野生動物蛔蟲4個樣品中，獵豹蛔蟲(CH1、CH2)位于獨立分支上，白獅蛔蟲(WL1、WL2)與獵豹蛔蟲(CH1、CH2)位于同一分支上，四個樣品處在同一個獨立分支上；獵豹蛔蟲(CH1、CH2)和白獅蛔蟲(WL1、WL2)與 GenBank 登錄號 JF780951.1(獅弓蛔蟲)位于同一大分支上；獵豹蛔蟲、白獅蛔蟲、JF780951.1(獅弓蛔蟲)與 GenBank 登錄號 AB446546.1：貍貓弓首蛔蟲；JF780942.1：貓弓首蛔蟲；JF780951.1：獅弓蛔蟲；KC293913.1：犬弓首蛔蟲；KC998824.1：豬蛔蟲位于不同的大分支上。

圖2 蛔蟲Pcox1序列系統(tǒng)進化樹

AB446546.1：貍貓弓蛔蟲； JF780942.1：貓弓首蛔蟲； JF780951.1：獅弓蛔蟲； KC293913.1：犬弓蛔蟲； KC998824.1：豬蛔蟲

2.2.2pcox1基因序列同源性分析 利用 DNAStar 5.0 的 MegAlign 軟件同源性分析顯示，白獅蛔蟲(WL1、WL2)序列差異達 4.2%；獵豹蛔蟲(CH1、CH2)序列差異 0.7%；獵豹蛔蟲(CH1、CH2)與白獅蛔蟲(WL1、WL2)序列平均差異 3.6757%，且與 GenBankTM收錄登錄號 JF780951.1(獅弓蛔蟲)比較：白獅蛔蟲(WL1、WL2)序列平均差異4.05%，獵豹蛔蟲(CH1、CH2)序列平均差異 2.5%；與 GenBankTM登錄號 AB446546.1：貍貓弓蛔蟲；JF780942.1：貓弓首蛔蟲；KC293913.1：犬弓手蛔蟲；KC998824.1：豬蛔蟲序列相比差異均超過10.1%以上。

圖3 線粒體DNA pcox1 基因片段的相似性和差異性(%)

注：Line1-9: CH2，CH1，WL2，WL1，AB446546.1(貍貓弓蛔蟲), JF780942.1(貓弓首蛔蟲), JF780951.1(獅弓蛔蟲), KC293913.1(犬弓手蛔蟲), KC998824.1(豬蛔蟲)

3 討論

本研究對湖南省長沙生態(tài)動物園2種野生動物4個蛔蟲樣品的Pcox1 基因序列進行遺傳多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，與 GenBank 收錄 JF780951.1(獅弓蛔蟲)序列用 Blast 軟件比較，主要極少數(shù)的堿基置換、顛換、缺失及無差異，白獅蛔蟲WL1、WL2 與 JF780951.1 基因序列差異 0～1.0%；獵豹蛔蟲 CH1、CH2 與JF780951.1 基因序列差異 1.0%；利用 DNAStar 5.0 的 MegAlign 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹顯示，白獅蛔蟲 WL1、WL2 和獵豹蛔蟲 CH1、CH2 位于同一分枝上，并與JF780951.1(獅弓蛔蟲)最近，與其他序列相差較遠；利用 DNAStar 5.0 的 MegAlign軟件差異性比較，GenBankTM收錄登錄號 JF780951.1(獅弓蛔蟲)與白獅蛔蟲(WL1、WL2)基因序列平均差異 4.05%，與獵豹蛔蟲(CH1、CH2)基因序列平均差異為 2.5%，與其他序列相比差異均在 10.1%以上。因此，這來自于兩種動物的4個蛔蟲樣品均為獅弓蛔蟲。

線粒體DNA (mtDNA)基因組缺乏細胞核基因組中的保護機制，變異較為明顯，能夠反映較短時間內(nèi)的進化事件，被廣泛應用于物種及種下關系的鑒別[15]。 本研究結(jié)果揭示mtDNA 中的Pcox1 序列可作為遺傳標記鑒定蛔蟲蟲種，對今后野生動物寄生蟲病的蟲種分子鑒定、群體遺傳、系統(tǒng)進化研究和流行病學調(diào)查具有一定的指導意義。