段晶晶，羅建讓，李 想，張慶雨，張延龍

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

植物器官，比如花瓣、果實(shí)和葉片的呈色主要是由于植物體中積累的色素所導(dǎo)致的。植物體中主要有3類色素：類黃酮、葉綠素和類胡蘿卜素[1-2]。葉綠素包括葉綠素a和葉綠素b，是植物綠色器官呈色的主要色素。類胡蘿卜素通常和葉綠素共同存在于植物的葉片中，使植物呈現(xiàn)黃色至橘色[3-5]。類黃酮主要包括花青素、黃酮醇、原花青素等[1]，它們能使植物的花瓣、葉片、果實(shí)、種子及其他組織呈現(xiàn)橘黃、紅色至藍(lán)色等一系列的顏色。其中，花青素是主要的色素物質(zhì)，黃酮醇作為輔助色素也發(fā)揮著重要作用[6-7]。

類黃酮的合成代謝主要受兩類基因控制：一類是結(jié)構(gòu)基因，它們直接編碼類黃酮生物合成酶類物質(zhì)，其中包括查耳酮合成酶基因(CHS)、查耳酮異構(gòu)酶基因(CHI)、黃烷酮羥化酶基因(F3H)、類黃酮羥化酶基因(F3′H)、二氫黃酮醇還原酶基因(DFR)、花青素合成酶基因(ANS)、黃酮醇合成酶基因(FLS)、無色花青素還原酶基因(LAR)、花青素還原酶基因(ANR)等；另一類是調(diào)節(jié)基因(轉(zhuǎn)錄因子基因)，它們能夠調(diào)節(jié)類黃酮生物合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的強(qiáng)度、程式以及色素在空間和時間上的積累[8]。近年來的研究表明，類黃酮的生物合成過程主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。主要有3大類轉(zhuǎn)錄因子參與了類黃酮合成的調(diào)控，它們分別為 MYB、bHLH、WD40。在這3類轉(zhuǎn)錄因子中，MYB是調(diào)控類黃酮生物合成的主要轉(zhuǎn)錄因子，而bHLH、WD40通常作為輔助轉(zhuǎn)錄因子，與MYB蛋白形成復(fù)合體，增強(qiáng)MYB轉(zhuǎn)錄因子對類黃酮合成的調(diào)控能力[9-10]。

牡丹(Paeoniasuffruticosa)是中國的十大傳統(tǒng)名花之一，享有國色天香的美譽(yù)。然而牡丹花期短且集中，因此具有更長觀賞時間的彩色葉牡丹品種培育將是今后牡丹育種的一個重要方向。作為春色葉植物，牡丹新生葉片呈現(xiàn)紫紅色，隨著葉片的發(fā)育，紫紅色逐漸褪去。通過對牡丹春季葉片紅色消退機(jī)制的研究將有助于人們采取相應(yīng)措施干擾該過程，進(jìn)而培育紅色葉牡丹品種。目前，在牡丹上，人們的研究多集中在牡丹花瓣類黃酮色素成分分析及相關(guān)基因克隆[11-14]、籽油成分分析及籽油提取工藝研究[15-16]，而對牡丹春季葉片紅色消退過程中色素水平及相關(guān)基因的研究未見報道。

本研究以牡丹品種‘滿園春光’葉片為材料，通過紫外分光光度法，測定了牡丹春季葉片紅色消退過程中不同時期葉片中花青素、原花青素、黃酮醇、葉綠素及類胡蘿卜素含量，根據(jù)課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選得到的類黃酮合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因與轉(zhuǎn)錄因子基因的序列設(shè)計引物，利用熒光定量PCR檢測類黃酮生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因與轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)量，明確二者在牡丹葉片紅色消退過程中與相應(yīng)色素含量的相關(guān)性，探究類黃酮生物合成相關(guān)基因的表達(dá)對牡丹春季葉片紅色消退的影響，為全面解析牡丹春季葉片紅色消退分子機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為日后采用分子手段進(jìn)行紅色葉牡丹品種定向培育提供基因資源。

1 材料和方法

1.1 植物材料

本試驗(yàn)以生長在西北農(nóng)林科技大學(xué)牡丹資源圃中的牡丹品種‘滿園春光’為研究材料。于2017年3月至4月采集牡丹‘滿園春光’4個不同葉色時期(S1，葉正面、葉背面均為紫紅色；S2，葉正面僅葉邊緣為紫紅色，葉基部有黃綠色顯現(xiàn)，葉背面為紫紅色；S3，葉正面紫紅色完全消失，葉背面僅葉邊緣為紫紅色；S4，葉片完全呈現(xiàn)出黃綠色)的葉片樣本。為避免其他生物體(節(jié)肢動物、真菌、細(xì)菌)對基因表達(dá)的影響，僅采集健康的、無菌無病蟲害的組織。所有的葉片樣本采集后用錫箔紙包好，立即用液氮冷凍，然后保存在-80 ℃冰箱用于后續(xù)RNA提取以及葉片中色素含量的測定。

1.2 葉色表型測定

分別使用英國皇家園藝學(xué)會比色卡(Royal Horticultural Society Colour Chart，RHSCC)及色差儀(CR-400，Japan)對牡丹‘滿園春光’不同時期的葉片顏色進(jìn)行定性和定量分析。通過測定顏色參數(shù)明度(L*)、紅度(a*)及藍(lán)度(b*)值，計算出色度(C*)，計算公式為C*=[(a*)2+(b*)2]1/2。每個時期的葉片重復(fù)測定3次。

1.3 葉片色素的提取與測定

1.3.1葉綠素及類胡蘿卜素稱取約0.1 g 的葉片樣品，將葉片于液氮中研磨成粉末，加入10 mL 80% 丙酮，超聲波提取30 min，然后置于4 ℃冰箱密閉黑暗萃取24 h，12 000 r/min離心10 min，取上清液，過濾定容至10 mL。用酶標(biāo)儀測定440、645和663 nm波長下的吸光度值，并計算葉綠素、類胡蘿卜素的含量。設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3.2花青素及黃酮醇用1%鹽酸甲醇配制0.1 mg·mL-1矢車菊素-3-葡糖苷(Cy-3)標(biāo)準(zhǔn)液和2 mg·mL-1蘆丁(Rutin)標(biāo)準(zhǔn)液，準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL離心管中，1%鹽酸甲醇定容至10 mL，以0 號為空白，分別測定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長530和350 nm處的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為x軸，吸光度值為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將葉片于液氮中研磨成粉末，稱取約0.1 g葉片樣品，加入10 mL 1% 鹽酸甲醇 ( 97 mL 甲醇+3 mL 36% 鹽酸)，超聲波提取30 min，然后置于4 ℃冰箱密閉黑暗萃取24 h，12 000 r/min離心10 min，取上清液，過濾定容至10 mL。用酶標(biāo)儀測定530和350 nm波長下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算花青素及黃酮醇的含量。設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3.3原花青素將葉片置于研缽中，用液氮將其研磨成粉末，稱取約0.1 g葉片粉末，加入1 mL 60%乙醇，用超聲提取法進(jìn)行提取，超聲功率300 W，破碎5 s，間歇8 s，提取30 min，25 ℃ 12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，過濾，60%乙醇定容至1 mL。用60%乙醇提取液將原花青素標(biāo)準(zhǔn)品配成10 mg·mL-1母液，標(biāo)準(zhǔn)液梯度稀釋為5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156、0.078、0.039、0.02、0.01 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)植物原花青素含量檢測試劑盒(Solarbio)使用說明書，分別對空白管(40 μL H2O+160 μL工作液)、標(biāo)準(zhǔn)管(40 μL標(biāo)準(zhǔn)液+160 μL工作液)、測定管(40 μL樣本+160 μL工作液)和對照管(40 μL樣本+160 μL H2O)加樣，工作液為11%鹽酸與香草醛1∶1混合液?；靹蚝?，30 ℃水浴30 min，立即于96孔板中檢測500 nm處吸光度值，計算ΔA測定=A測定管-A對照管，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。以ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品濃度，計算出原花青素含量。設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.4 牡丹葉片總RNA提取與cDNA合成

采用北京天根公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒，對牡丹‘滿園春光’4個不同時期的葉片進(jìn)行總RNA提取。分光光度計測定其濃度及凝膠電泳檢測其完整性之后，以1 μg總RNA為模板，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser的說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。首先，加入2 μL 5×gDNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser以及相應(yīng)體積的RNA，ddH2O補(bǔ)足至10 μL，42 ℃ 2 min以去除基因組DNA；第二步，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，加入10 μL第一步反應(yīng)液，1 μL PrimeScriptRTEnzyme Mix I，1 μL RT Primer Mix，4 μL 5×PrimeScript Buffer 2，4 μL RNase-Free dH2O，總反應(yīng)體系為20 μL，PCR程序設(shè)置為：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃保存。

1.5 qRT-PCR表達(dá)分析

為研究牡丹‘滿園春光’葉片類黃酮生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因與轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)對葉色的影響。根據(jù)課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選的可能與葉片類黃酮合成相關(guān)的5個轉(zhuǎn)錄因子(PsMYB113、PsMYB4、PsMYBF1、PsbHLH1、PsWD40-1)基因序列以及注釋為CHS、CHI、F3H、F3′H、DFR、ANS、FLS、LAR、ANR的基因序列[17]，設(shè)計實(shí)時定量PCR特異性引物，以Ubiquitin為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時定量PCR(表1)。以反轉(zhuǎn)錄得到的牡丹‘滿園春光’不同時期葉片(S1～S4)的cDNA作為模板，參照TaKaRa公司的熒光定量試劑盒SYBR?Premix ExTaqTMⅡ說明書，在Step One Plus熒光定量PCR儀上檢測牡丹‘滿園春光’不同時期葉片中的轉(zhuǎn)錄因子基因與結(jié)構(gòu)基因的相對表達(dá)量。反應(yīng)體系(20 μL)為：SYBR?Premix ExTaqTMⅡ 10 μL，PCR上游、下游引物(10 μmol·L-1)各0.8 μL，cDNA模板0.8 μL，ROX染液0.4 μL，ddH2O 7.2 μL，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，30 s；95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。溶解曲線由軟件自動生成，使用2-ΔΔCT方法計算基因相對表達(dá)水平，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹‘滿園春光’春季葉色特征

牡丹‘滿園春光’的葉片在春季呈現(xiàn)出明顯的顏色變化，其新生葉片為紫紅色，隨著葉片發(fā)育，紫紅色消失，黃綠色逐漸形成，并且葉正面和葉背面呈現(xiàn)出2種不同的顏色變化(圖1)。為明確牡丹不同時期的葉色表型，分別采用RHSCC和色差儀對牡丹‘滿園春光’4個不同發(fā)育時期的葉片顏色進(jìn)行定性和定量描述，其中L*為明度，L*值越大表示亮度越高；a*為紅度，+a*表示偏紅，-a*表示偏綠；b*為藍(lán)度，+b*表示偏黃，-b*表示偏藍(lán)，結(jié)果如表2所示。葉背面與葉正面的L*、a*、b*、C*值基本呈現(xiàn)出一致的變化趨勢。其中，兩者的L*、b*值隨著葉片的發(fā)育逐漸升高，在S4時期達(dá)到最高，而葉片b*值的升高則表明隨著葉片的發(fā)育葉片顏色逐漸變黃；葉片a*值呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，并在葉片發(fā)育初期時最大，葉片顏色最紅，隨著葉片發(fā)育a*值降低，葉片顏色也逐漸變綠，這與肉眼所見的顏色變化規(guī)律基本一致；葉片C*值隨著葉片發(fā)育則呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，在S4時期最高。總體而言，牡丹‘滿園春光’葉背面的L*、a*值要高于葉正面，而b*、C*值則低于葉正面(表2)。

表1 牡丹‘滿園春光’熒光定量表達(dá)分析所用引物

S1.葉正面、葉背面均為紫紅色；S2.葉正面僅葉邊緣為紫紅色，葉基部有黃綠色顯現(xiàn)，葉背面為紫紅色；S3. 葉正面紫紅色完全消失，葉背面僅葉邊緣為紫紅色；S4.葉片完全呈現(xiàn)出黃綠色；下同圖1 牡丹‘滿園春光’不同葉色時期的葉片表型S1. Both the adaxial (upper) and abaxial (lower) surface of leaves were purplish-red; S2. The abaxial (lower) surface of leaves and the edge on the adaxial (upper) surface of leaves were purplish-red, the leaf base on the adaxial (upper) surface of leaves were yellow-green; S3. The purplish-red on the adaxial (upper) surface of leaves was completely disappeared, only the edge on the abaxial (lower) surface of leaves were purplish-red; S4. The leaves were completely appeared yellow-green. The same as belowFig.1 The leaf phenotype of P. suffruticosa ‘Manyuan Chunguang’ in different leaf color stages

2.2 牡丹春季葉片不同發(fā)育時期各類色素含量

對牡丹‘滿園春光’不同發(fā)育時期葉片中葉綠素、類胡蘿卜素、花青素、原花青素及黃酮醇含量測定，結(jié)果如圖2所示。首先，牡丹‘滿園春光’葉片中的黃酮醇含量呈現(xiàn)先上升后略微下降的趨勢，其含量從S1至S3時期逐漸升高，并且在S3時期達(dá)到最高(10.34 mg·g-1)；S4時期的黃酮醇含量低于S3時期，但仍顯著高于前2個時期。其次，葉片花青素含量在前2個葉色時期都相對較高，且在S2時期最高(1.37 mg·g-1)，而在后2個時期(S3、S4)相對較低，并以S4時期最低(0.18 mg·g-1)，S2時期葉片中花青素含量約為S4時期的7.6倍，這與肉眼所觀察到的葉片顏色變化基本一致，表明葉片顏色表型的變化與葉片中花青素含量的變化正相關(guān)。再次，葉片中原花青素含量從S1至S4時期呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，其含量在S1最高，S4最低，且各葉色時期之間均差異顯著。最后，牡丹葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量均隨著牡丹葉片的發(fā)育而逐漸升高，并在S4時期達(dá)到最高值，分別為2.23和0.41 mg·g-1。可見，牡丹‘滿園春光’春季葉片發(fā)育初期呈現(xiàn)紫紅色是由于葉片中含有大量的花青素，而含少量葉綠素和類胡蘿卜素；在葉片發(fā)育后期，由于葉片中花青素合成減少，葉綠素、類胡卜素及黃酮醇的大量合成，從而導(dǎo)致紫紅色褪去，黃綠色顯現(xiàn)。

不同小寫字母表示葉色時期間Duncan檢驗(yàn)在0.05水平有顯著性差異；下同圖2 牡丹‘滿園春光’不同葉色時期葉片中的色素含量The different normal letters indicate significant difference among stages at 0.05 level by Duncan test. The same as belowFig.2 The pigment contents at different color stages of P. suffruticosa ‘Manyuan Chunguang’ leaves

葉片Leaf時期Stage顏色ColorL?a?b?C?葉正面Adaxial (upper) surface of leavesS159A31.49±0.43c12.37±0.73a4.34±0.40a13.11±0.82cS2135C34.19±0.13b-5.35±0.41b11.44±0.06b12.63±0.12cS3141B38.76±1.28a-14.41±0.30c21.40±0.99c25.80±0.95bS4141A40.07±0.45a-16.24±0.34d23.17±0.79d28.30±0.58a葉背面Abaxial (lower) surface of leavesS159A31.49±0.43d12.37±0.73a4.34±0.40d13.11±0.82bS259C41.24±1.21c3.35±0.77b8.96±0.74c9.60±0.71cS359D44.36±0.25b-1.59±0.40c11.36±0.45b11.49±0.51bS4148D59.51±1.11a-11.92±0.54d18.25±1.10a21.74±1.15a

2.3 類黃酮合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因在牡丹不同時期葉片中的表達(dá)模式

為探究類黃酮合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因與牡丹葉色之間的關(guān)系，利用實(shí)時熒光定量PCR測定了類黃酮生物合成途徑中9個結(jié)構(gòu)基因在不同時期葉片中的表達(dá)量，結(jié)果見圖3。首先，PsCHS、PsCHI、PsF3H、PsF3′H、PsDFR、PsANS基因相對表達(dá)量在牡丹葉片不同發(fā)育時期均基本呈現(xiàn)出相同的先升高后降低的變化趨勢，并均在S2時期達(dá)到最大值。其中PsCHS、PsCHI、PsDFR、PsANS基因表達(dá)量均在S4時期最低，且除PsCHI外均顯著低于前3個時期的表達(dá)量，而PsF3H、PsF3′H的表達(dá)量在S1時期最低，均顯著低于后期(S2～S4)的表達(dá)量。PsDFR、PsANS在S2時期表達(dá)量最高，其次為S1和S3時期，S4時期的表達(dá)量最低，這與葉片花青素含量的變化趨勢一致，且呈極顯著正相關(guān)(表3)，表明PsDFR、PsANS可能是牡丹葉片花青素合成的重要結(jié)構(gòu)基因。其次，PsANR基因的表達(dá)量從S1到S4時期呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，與原花青素含量的變化趨勢一致，呈極顯著正相關(guān)，而與黃酮醇含量、花青素含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(表3)，說明PsANR可能是牡丹葉片中原花青素合成的重要結(jié)構(gòu)基因。再次，PsLAR基因的相對表達(dá)量從S1到S4時期呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，其表達(dá)量在S1時期最低，S4時期最高，且各發(fā)育時期間差異顯著。同時，PsLAR基因的相對表達(dá)量與花青素含量、原花青素呈極顯著負(fù)相關(guān)(表3)。另外，PsFLS基因的表達(dá)量從S1到S3逐漸升高，在S4時期時低于S3時期，但是高于前2個時期，且與葉片中黃酮醇含量的變化趨勢呈極顯著正相關(guān)，而與花青素含量、原花青素含量呈顯著負(fù)相關(guān)(表3)，表明PsFLS可能是牡丹葉片黃酮醇合成的重要結(jié)構(gòu)基因。

2.4 類黃酮合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在牡丹不同時期葉片中的表達(dá)模式

由圖4可知，PsMYBF1相對表達(dá)量在S1時期最低，在S3時期的表達(dá)量最高，S3時期的表達(dá)量約為S1時期的2.5倍，S4時期的表達(dá)量略低于S3時期。PsMYBF1表達(dá)量在葉片不同發(fā)育時期的變化趨勢與葉片中黃酮醇含量、PsFLS表達(dá)量的變化呈顯著正相關(guān)(表4)，這表明PsMYBF1可能在牡丹葉片黃酮醇生物合成過程中有重要調(diào)控作用。同時，PsMYB113的表達(dá)量在牡丹葉片發(fā)育過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在S2時期最高，在S4時期表達(dá)量最低，S2時期的表達(dá)量約為S4時期的25倍，而S1、S3時期的表達(dá)量顯著低于S2時期，但顯著高于S4時期?？傮w而言，PsMYB113在牡丹葉片紅葉期的表達(dá)量相對較高，而在綠葉期的表達(dá)量相對較低，其表達(dá)模式與牡丹葉片中花青素含量、PsDFR、PsANS表達(dá)量的變化趨勢一致，且呈顯著正相關(guān)(表4)，表明PsMYB113可能對牡丹葉片花青素合成起正向調(diào)控作用。再次，PsMYB4的表達(dá)量從S1到S4時期呈現(xiàn)出逐步上升的趨勢，其表達(dá)量在S1時期最低，S4時期最高，S4時期的表達(dá)量約為S1時期的5倍，與葉片中花青素、PsDFR、PsANS表達(dá)量呈良好的負(fù)相關(guān)性(表4)，表明PsMYB4可能對牡丹葉片花青素合成起負(fù)向調(diào)控作用。另外，PsbHLH1在S2時期的表達(dá)量最高，在S1和S3時期的表達(dá)量差異不顯著，但均顯著高于S4時期。PsWD40-1的表達(dá)量在S3時期最高，S4時期最低，總體呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，且在各葉色時期間均差異顯著。

圖3 牡丹‘滿園春光’不同葉色時期葉片中類黃酮合成結(jié)構(gòu)基因的相對表達(dá)量Fig.3 Expression pattern of structure genes involved in flavonoid synthesis at different color stages in P. suffruticosa ‘Manyuan Chunguang’ leaves

類黃酮Flavonoid結(jié)構(gòu)基因Structure genePsCHSPsCHIPsF3HPsF3′HPsDFRPsANSPsFLSPsLARPsANR黃酮醇 Flavonol0.0800.317 0.523 0.714??-0.339-0.281 0.984??0.677?-0.809??花青素Anthocyanin 0.714??0.442 0.078-0.190 0.913?? 0.860??-0.607?-0.948??-0.949??原花青素Proanthocyanidin 0.5020.259-0.201-0.262 0.685? 0.686?-0.668?-0.977??0.990??

注：**和*分別表示在0.01和0.05水平上顯著相關(guān)；下同

Note：**and * indicate significant correlation at 0.01 and 0.05 levels, respectively. The same as below

圖4 牡丹‘滿園春光’不同葉色時期葉片中轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)量Fig.4 Expression pattern of transcription factor gene at different color stages in P. suffruticosa ‘Manyuan Chunguang’ leaves

項(xiàng)目 ItemPsMYBF1PsMYB113PsMYB4PsbHLH1PsWD40-1PsCHS-0.1160.940??-0.4180.5510.409PsCHI0.1760.869??-0.3400.695?0.823??PsF3H0.5250.605?0.2580.0350.387PsF3′H0.638?0.614?0.2030.2300.699?PsDFR-0.4310.946??-0.751??0.789??0.426PsANS-0.3280.946??-0.597?0.645?0.346PsFLS0.966??0.0300.678?-0.2140.523PsLAR0.674?-0.678?0.972??-0.856??-0.258PsANR-0.860??0.585?-0.931??0.714??0.039黃酮醇 Flavonol0.963??-0.0530.677?-0.2220.523花青素 Anthocyanins-0.737?0.766??-0.885??0.749??0.161原花青素 Proanthocyanidin-0.873?0.589-0.953??0.733??0.062

3 討 論

類黃酮代謝過程受多個結(jié)構(gòu)酶基因的控制，如CHS、CHI、F3H、F3′H、FLS、DFR、ANS等。其中，F(xiàn)LS催化二氫黃酮醇合成相對應(yīng)的黃酮醇類物質(zhì)，DFR催化二氫黃酮醇形成無色花青素，ANS催化無色花青素形成有色花青素?，F(xiàn)有研究表明，DFR、ANS等類黃酮合成后期結(jié)構(gòu)基因是控制花青素合成的關(guān)鍵基因，而FLS是控制黃酮醇合成的關(guān)鍵基因[18-19]。FLS和DFR之間存在著競爭關(guān)系，二者競爭同一底物二氫黃酮醇(圖5)。大量研究表明，DFR和FLS基因的表達(dá)，關(guān)系著花青素合成途徑和黃酮醇合成途徑對代謝流的競爭，影響各自支路的代謝強(qiáng)弱，最終影響著花青素苷和黃酮醇的生成量[20]。在矮牽牛(Petuniahybrida)中，將FLS基因反義表達(dá)，降低了矮牽牛花瓣中的黃酮醇含量，同時增加了花青素的含量[21]。在煙草中過表達(dá)海棠(Maluscrabapple)、玫瑰(Rosarugosa)、桃(Prunuspersica)、金花茶(Camellianitidissima)中的FLS基因，其轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)黃酮醇含量顯著升高，而花青素含量則顯著降低，顏色變淺，而過表達(dá)DFR基因則會下調(diào)內(nèi)源FLS基因的表達(dá)量，降低黃酮醇含量，同時增加了花青素含量，使植物體顏色變深[22-23]。由此推測，PsDFR、PsANS在牡丹葉片發(fā)育后期的低表達(dá)，影響了葉片中花青素的合成與積累。同時，PsFLS在后期的高表達(dá)促使大部分二氫黃酮醇朝著黃酮醇途徑的方向發(fā)展，葉片中合成大量的黃酮醇類物質(zhì)。

圖5 類黃酮生物合成途徑簡圖Fig.5 The biosynthetic pathway of flavonoids

類黃酮生物合成的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行[24]。調(diào)控類黃酮物質(zhì)生物合成的轉(zhuǎn)錄因子主要有 MYB、bHLH、WD40，而MYB是調(diào)控類黃酮生物合成的最重要轉(zhuǎn)錄因子。金魚草(Antirrhinummajus)中的MYB基因Rosea1和Venosa，能激活花青素合成結(jié)構(gòu)基因CHI、F3H、F3′H、FLS、DFR和ANS的表達(dá)，從而影響花青素積累[25]。番薯(Ipomoeabatatas)中的IbMYB1能特異地調(diào)控地下塊根中結(jié)構(gòu)基因CHS、F3H、DFR、ANS的表達(dá)，從而影響花青素的合成[26]。在番茄(Lycopersiconesculentum)中，LeANT1能夠調(diào)控CHS、CHI、DFR等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而控制花青素的合成與積累[27]。從蘋果(Malusdomestica)中分離到的MdMYB1能夠調(diào)控果皮中結(jié)構(gòu)基因MdDFR、MdANS的表達(dá)以及花青素的生物合成，并且與花青素積累、MdDFR、MdANS的表達(dá)正相關(guān)[28]。本研究中，PsMYB113的表達(dá)模式與PsDFR、PsANS表達(dá)量、花青素含量的變化趨勢呈良好的正相關(guān)性，表明PsMYB113可能對牡丹葉片花青素合成起正向調(diào)控作用。

在MYB轉(zhuǎn)錄因子當(dāng)中，與黃酮醇合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子一般不具有與bHLH相互作用的基序，該類轉(zhuǎn)錄因子通常單獨(dú)發(fā)揮作用，從而調(diào)節(jié)黃酮醇物質(zhì)的合成[20]，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)中的AtMYB12或AtMYB111均能獨(dú)立地激活黃酮醇合成相關(guān)基因如CHS、CHI、F3H、FLS的表達(dá)[29]。在葡萄(Vitisvinifera)中，VvMYB5a和VvMYBF1能夠調(diào)控黃酮醇生物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)和體內(nèi)黃酮醇的合成積累[30-31]。本研究中，PsMYBF1表達(dá)量的變化趨勢與牡丹葉片中黃酮醇水平、PsFLS表達(dá)量的變化趨勢基本一致，并且呈顯著正相關(guān)，表明PsMYBF1可能是調(diào)控牡丹葉片黃酮醇合成的重要轉(zhuǎn)錄因子。

調(diào)控類黃酮合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子，并非全都是對類黃酮物質(zhì)的合成起轉(zhuǎn)錄激活作用，有些MYB轉(zhuǎn)錄因子則起著負(fù)向調(diào)控作用。如擬南芥中的AtMYBL2，該基因的表達(dá)能夠下調(diào)擬南芥體內(nèi)花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，從而抑制花青素的合成[32]。同時，在擬南芥中過表達(dá)AtMYB3、AtMYB6會引起花青素含量的下降, 說明AtMYB3、AtMYB6可能對擬南芥花青素的合成起抑制作用[33]。FaMYB1是草莓(Fragariaananassa)中發(fā)現(xiàn)的抑制花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子基因，該基因的表達(dá)與花青素的積累呈負(fù)相關(guān)，在煙草中過表達(dá)FaMYB1會抑制煙草體內(nèi)花青素的積累，同時也降低了黃酮醇的含量[34]。MdMYB6是從蘋果中鑒定出的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，該基因在擬南芥中的過表達(dá)抑制了植株體內(nèi)花青素的合成與積累，同時下調(diào)了花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[35]。本研究中，PsMYB4的表達(dá)模式與牡丹葉片花青素含量及花青素合成重要結(jié)構(gòu)基因PsDFR、PsANS表達(dá)量的變化趨勢呈顯著負(fù)相關(guān)性，暗示PsMYB4可能對牡丹葉片花青素合成起負(fù)向調(diào)控作用。

綜上所述，推測牡丹‘滿園春光’春季葉片紅色消退的可能機(jī)制為：在牡丹葉片發(fā)育前期，環(huán)境因子(低溫)誘導(dǎo)PsMYB113的高表達(dá)，PsMYB113的表達(dá)激活了PsDFR、PsANS的表達(dá)，牡丹新葉中大量合成花青素(花青素可以提高植物的抗寒性)，使葉片呈現(xiàn)紫紅色；隨著葉片發(fā)育，相應(yīng)環(huán)境因子發(fā)生變化(溫度升高)，該因子誘導(dǎo)PsMYB4的表達(dá)，而抑制PsMYB113的表達(dá)，PsMYB4的高表達(dá)抑制了PsDFR、PsANS的表達(dá)，進(jìn)而使花青素合成減少。同時，PsMYBF1的高表達(dá)激活了PsFLS的大量表達(dá)，進(jìn)而與PsDFR競爭底物，使本該合成花青素的二氫黃酮醇大量流向黃酮醇合成的方向，從而使牡丹葉片中花青素的合成進(jìn)一步減少。與此同時，葉片中葉綠素與類胡蘿卜素的大量合成削弱了花青素對牡丹葉片顏色的影響。上述因素相互疊加從而導(dǎo)致了牡丹葉片紫紅色逐漸消退，黃綠色形成。但該調(diào)控假設(shè)有待后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。