混合型飼料添加劑中1，8 -桉葉素和松油烯-4-醇含量檢測方法研究

林茂發(fā) 黃永輝 胡朝陽 黃何何 高希

摘要：建立了同時(shí)檢測茶樹油混合型飼料添加劑中1，8-桉葉素和松油烯-4-醇含量的氣相色譜方法。樣品采用乙醇提取，經(jīng)毛細(xì)管相色譜柱（ZB-35，30m×0.32mm×0.25um）分離，氫火焰離子化檢測器測定，外標(biāo)法定量，并采用氣質(zhì)確證。方法學(xué)研究結(jié)果表明，目標(biāo)化合物1，8-桉葉素和松油烯-4-醇在0.01～10 mg/mL濃度范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為r≥0.9990，檢出限分別為15mg/kg、10mg/kg;回收率為80.8～102.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.23～4.57%。該方法簡便、快捷，靈敏度和準(zhǔn)確度均較高可以用于茶樹油混合型飼料添加劑樣品中1，8-桉葉素和松油烯-4-醇的測定。

關(guān)鍵詞：茶樹油;混合型飼料添加劑;1，8-桉葉素;松油烯-4-醇;氣相色譜法;氣質(zhì)確證

養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中由于動物的疾病等原因可能使用各種抗生素，抗生素對動物的疾病等有一定的治療效果，但是長期大量不合理使用會產(chǎn)生負(fù)作用。一方面經(jīng)常喂養(yǎng)抗生素會破壞動物體腸道的有益菌群并使動物體內(nèi)產(chǎn)生耐藥菌株形成抗藥性，降低動物的免疫能力，增大治療和養(yǎng)殖難度。另一方面，抗生素類藥物及其代謝物在動物體內(nèi)經(jīng)過富集.會導(dǎo)致畜禽魚體產(chǎn)品獸藥殘留超標(biāo)，近年來檢測出的蛋類、畜禽肉類、魚肉中抗生素及其代謝物超標(biāo)，究其原因均為養(yǎng)殖戶不合理使用抗生素引起的，畜禽魚肉產(chǎn)品抗生素及其代謝物殘留量一般極低，但長期食用，會對人體健康產(chǎn)生危害。因此開發(fā)新型的、高效、保障養(yǎng)殖產(chǎn)品安全、能夠替代抗生素的飼料添加劑，對推動養(yǎng)殖業(yè)向健康養(yǎng)殖、無抗養(yǎng)殖，提高養(yǎng)殖產(chǎn)品安全，滿足人們對食品安全需求，具有積極的意義。

經(jīng)過多年的養(yǎng)殖實(shí)踐表明，采用植物提取物或中藥作為飼料添加劑對動物體不會產(chǎn)生毒害與殘留及生抗藥性而且可促進(jìn)動物肌體生長，能夠改善畜禽魚肉的品質(zhì)，可以長期拌料喂養(yǎng)，提高畜禽魚的免疫力，采用養(yǎng)防并舉，實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖業(yè)綠色，高效，環(huán)?？沙掷m(xù)發(fā)展。目前，飼料添加劑企業(yè)利用我國植物及中草藥豐富的資源大力開發(fā)植物提取物和中藥類型的功能型飼料添加劑以取代抗生素的使用，養(yǎng)殖戶也逐漸接受無抗養(yǎng)殖的理念。相對于市場上種類繁多的新型飼料添加劑，質(zhì)量監(jiān)管部門能提供的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)顯得有些不足，因此，有必要加強(qiáng)該類新型飼料添加劑檢測方法的開發(fā)與研究。

本實(shí)驗(yàn)研究對象為以互葉白千層茶樹（MelaleucaAlternefolia Tea Tree）枝葉為原料生產(chǎn)的茶樹油（Tea Tree oil，TTO）為活性物，以玉米淀粉為載體，以豆油（或同類型的植物油）為稀釋劑按一定比例均勻混合制成的混合型飼料添加劑產(chǎn)品。茶樹油是一種天然的植物提取精油，在日化、食品、醫(yī)藥、生物農(nóng)藥等方面有廣泛的應(yīng)用。由于茶樹油具有廣譜抗微生物，抑菌、殺菌、消炎、驅(qū)蟲等功能，用于飼料添加劑可以治療動物的某些疾病，提高動物的免疫能力，降低餌料系數(shù)及改善畜禽魚肉的品質(zhì)，是農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄（2013）》允許使用的飼料添加劑之一，是種替代抗生素的理想飼料添加劑。茶樹油組成成分較為復(fù)雜，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的化學(xué)分子有100多種，按照主要特征組分組成可分為三種類型，分別為：松油烯-4-醇型（松油烯-4-醇≥30%）、1，8-桉葉素型（1，8-桉葉素≥35%）和異松油烯型（異松油烯≥40%），國內(nèi)市場上應(yīng)用的主要為4-松油醇型和1，8-桉葉素型，我國茶樹油作為飼料添加劑在養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)有一定的研究，但對茶樹油飼料添加劑的檢測方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)開發(fā)出氣相色譜法（GC-FID）同時(shí)檢測茶樹油飼料添加劑中的特征組分松油烯-4-醇（terpinen-4-olcas no 562-74-3）和1，8-桉葉素（1，8-Cineolecas no 470-82-6）的檢測方法，并對目標(biāo)化合物采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（ GC/MS）確證，實(shí)驗(yàn)證明該方法準(zhǔn)確快捷，可以用于茶樹油飼料添加劑的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與設(shè)備

氣相色譜儀帶自動進(jìn)樣系統(tǒng)聯(lián)FID檢測器及配套丁作站（日本SHIMADZU公司），石英毛細(xì)管柱（ZB-35，30m×0.32mm×0.25um）美國Agilent公司.6890N/5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司;ZB-35MS石英毛細(xì)柱（30m×0.25mm×0.25μm）美國Agilent公司，BT224S分析天平，德國Sartorius公司;XH-B旋渦混均器，江蘇康健醫(yī)療用品有限公司;調(diào)速多用振蕩器（上海研永超聲設(shè)備有限公司）;高速冷凍離心機(jī)，Aanti J-E，美國BeckmanCoulter公司：具塞玻璃刻度管（10毫升，25毫升兩種規(guī)格）;50ML具塞塑料離心管。

1.2材料與試劑

甲醇、乙醇、乙腈、丙酮均為分析純，1，8-桉葉素標(biāo)準(zhǔn)品純度大于99.0%（德國Dr.Ehrenstorfer公司），松油烯-4 -醇標(biāo)準(zhǔn)品純度大于98%（德國Dr - Ehrenstorfer公司）。稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇溶解轉(zhuǎn)移到容量瓶中，并逐級稀釋成實(shí)驗(yàn)所需的的濃度。再配制成相應(yīng)濃度的混標(biāo)。

1.3方法

1.3.1色譜條件：進(jìn)樣口溫度：260℃;色譜柱升溫程序：50℃保留1min，10℃/min升至250℃，保留10min。檢測器（FID）溫度280℃，載氣，氮?dú)猓兌炔恍∮?9.999%）;燃?xì)?，氫氣（純度不小?9.99%）;空氣（壓縮空氣）;氣體流量：柱流量，1.85mLmin;氫氣40mL/min;空氣400mL/min;尾吹氣，30mL/min;進(jìn)樣量：1μL;分流比：50：1。

1.3.2樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品1克（精確至0.0001g），置于塑料離心管中，用4ml無水乙醇旋渦混均溶解后，在振蕩器上振搖3min后，于5000r/min條件下離心5 min，吸取上清液于玻璃刻度管中，重復(fù)上述操作一遍，再加入2ml無水乙醇重復(fù)上述操作一遍，定容，搖勻，置于-18℃條件下速凍1小時(shí)，過0.45um有機(jī)相濾膜后，上機(jī)檢測。

1.3.3測定

在上述選定的氣相色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液氣相色譜分析。

2結(jié)果與分析

2.1 色譜方法條件的選擇

分別取空白基質(zhì)樣品、茶樹油混合飼料添加劑樣品按上述前處理方法制備的溶液及混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.1色譜條件測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白基質(zhì)樣品在目標(biāo)化合物保留時(shí)間處無雜質(zhì)峰干擾，見圖二，圖三和圖四，表明樣品基質(zhì)中其他成分不干擾目標(biāo)化合物測定，并且能夠在最短的時(shí)間實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物完全分離，方法特異性強(qiáng)，適用于茶樹油混合型飼料添加劑中1，8-桉葉素和松油烯一4-醇含量測定。

2.2方法的線性范圍及檢測限

將1，8-桉葉素、松油烯-4-醇系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01mg/ml～10.00mg/ml）加入空白基質(zhì)中，在上述的氣相色譜條件下進(jìn)樣分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的線性同歸方程及相關(guān)系數(shù)，根據(jù)3倍噪比計(jì)算方法的檢測限，以10倍信噪比計(jì)算方法定量限。結(jié)果見表1

2.3 方法的回收率和精密度

向空白基質(zhì)樣品中分別添加Ⅰ（Sg/kg）、Ⅱ（10g/kg）、Ⅲ（50g/kg）三個(gè)濃度水平的混合標(biāo)樣，每個(gè)水平進(jìn)行6次平行測定，同收率和精密度結(jié)果見表2。

2.4溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

按上述的前處理方法制備樣品溶液，樣品溶液密封保存在室溫環(huán)境中，隔2h、4h、8h、12h、24h、48h按前述方法測定（1，8-桉葉素1.00g/kg，松油烯-4-醇29.00g/kg）的含量，結(jié)果見表3，結(jié)果表明樣品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 色譜柱的選擇

影響色譜柱分離效果的一個(gè)重要因素是固定相類型，目標(biāo)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和極性是本實(shí)驗(yàn)主要考慮的因素，茶樹油型飼料添加劑是以茶樹油為活性物，以玉米淀粉為載體，以豆油（或同類型的植物油）為稀釋劑按一定比例均勻混合制成的。因此選擇色譜柱除了要考慮1，8-桉葉素、松油烯-4-醇的分子結(jié)構(gòu)外，還要考慮茶樹油和其它基質(zhì)的干擾因素。本實(shí)驗(yàn)采用了3種不同極性的色譜柱，ZB-5、ZB-35及ZB-624毛細(xì)管色譜柱，綜合考慮靈敏度，峰形，分析時(shí)間，基線漂移等色譜分析因素，ZB-35毛細(xì)管色譜柱效果最好，因此以ZB-35毛細(xì)管色譜柱作為本試驗(yàn)用色譜柱。

2.6柱溫和柱流量的優(yōu)化選擇

由于茶樹油除了1，8-桉葉素和松油烯-4-醇外還有其它的眾多組分，有些組分和目標(biāo)化合物的出峰時(shí)間較接近，在確定優(yōu)選色譜柱后，氣相色譜法中能夠影響目標(biāo)化合物分離效果的因素主要為色譜柱的升溫程序和色譜柱的氣體流量。本研究反復(fù)實(shí)驗(yàn)比較了不同的初始溫度、升溫速率、柱流量后，確定儀器參數(shù)為：進(jìn)樣口溫度：260℃;色譜柱升溫程序：500℃保留1min，10℃ /min升至250℃，保留10min。檢測器（FID）溫度280℃。氣體流量：柱流量，2.00mL/min;氫氣48mL/min;空氣480mL/min;尾吹氣，30mL/min。

2.7提取溶劑的選擇

本研究實(shí)驗(yàn)采用了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮作為樣品的提取溶劑，實(shí)驗(yàn)表明丙酮提取物雜質(zhì)較多，對目標(biāo)化合物的定性容易生產(chǎn)的干擾。而甲醇，乙醇、乙腈這3種溶劑均能很好地提取目標(biāo)化合物，由于乙醇較其他溶劑毒性小，價(jià)格便宜，對環(huán)境無毒害，所以本研究實(shí)驗(yàn)選擇無水乙醇作為提取溶劑。

3 GC/M確證

在空白基質(zhì)中添加濃度為10g/kg水平的混標(biāo)，按1.3.2進(jìn)行前處理。

質(zhì)譜條件：載氣為高純氦氣，流速為2.0ml/min;采用分流進(jìn)樣，分流比為50：1;進(jìn)樣口溫度為260℃，初始溫度為50℃，以10℃/min升至200℃保持10min，離子源為EI源;電子能量為70eV;傳輸線溫度270℃;離子源溫度230℃;四級桿溫度150℃;溶劑延遲3min。采用Scan掃描模式，m/z質(zhì)量掃描的范圍為50～500 m/z?？傠x子流圖和質(zhì)譜圖見圖五和圖六。

4實(shí)際樣品測定

對企業(yè)生產(chǎn)的茶樹油混合型飼料添加劑進(jìn)行測定，準(zhǔn)確稱取樣品1克（精確至0.0001g），按1.3.2進(jìn)行前處理。采用GC-FID測定，色譜譜圖見圖七，測定結(jié)果與產(chǎn)品明示值相符。

5結(jié)論

本研究建立了茶樹油混合型飼料添加劑中1，8-桉葉素和松油烯-4-醇的氣相色譜法測定方法，能夠?qū)崿F(xiàn)簡單的樣品前處理和高通量檢測，方法特異性強(qiáng)并且具有較寬的線性范圍，十分顯著的線性關(guān)系、加標(biāo)回收率高、重現(xiàn)性好的優(yōu)點(diǎn);使用儀器設(shè)備普及率高，可在茶樹油混合型飼料添加劑中1，8-桉葉素和松油烯-4-醇的質(zhì)量檢測及標(biāo)準(zhǔn)制定中加以推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)（略）