水稻抗病蟲基因挖掘及聚合育種研究進展

鄒 拓，耿雷躍，張 薇，張啟星

（河北省農(nóng)林科學院濱海農(nóng)業(yè)研究所，河北 曹妃甸 063299）

水稻（Oryza sativa L.）是世界重要的糧食作物之一，全世界有50%以上的人口以稻米為主食，水稻的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)對保障世界糧食安全具有重要意義。但是，水稻產(chǎn)量受多種因素的影響，其中，生物因素是影響水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要因素之一[1]。

作物病蟲害是威脅糧食安全的主要因素之一。我國每年由于病蟲害造成的產(chǎn)量損失巨大。受品種種植單一、氣候、病原物變異以及外來生物入侵等因素的影響，新的病蟲害不斷出現(xiàn)，傳統(tǒng)病蟲害的發(fā)生規(guī)律發(fā)生改變，使得病蟲害防治工作遇到了更大的挑戰(zhàn)[2]。

病蟲害對水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)影響較大，隨著世界人口的日益增加，人類對水稻產(chǎn)量的需求也越來越多[3]。國外研究者認為，水稻的生產(chǎn)潛力可以達到10 t/hm2，但是由于病蟲害的影響，農(nóng)民實際收獲的產(chǎn)量大約為5 t/hm2[4]。因此，提高品種的抗病蟲害能力是水稻增產(chǎn)的重要措施。目前，生產(chǎn)上應用的大部分水稻品種（組合）抗病蟲能力較差，易遭受病蟲為害，導致產(chǎn)量和品質(zhì)不穩(wěn)定。而過去幾十年一直沿用的化學防治方法，因為存在高成本、高毒性、高殘留和造成環(huán)境污染等問題，也越來越受到人們的摒棄。為了解決使用化學農(nóng)藥引起的環(huán)境污染和食品安全問題，迫切需要從遺傳上對水稻品種的抗性進行改良[5]。長期實踐證明，利用抗性品種來防治病蟲害更加經(jīng)濟、高效和環(huán)保。

分子生物學的發(fā)展促使植物育種進入了生物技術(shù)與常規(guī)技術(shù)相結(jié)合的階段。目前，以分子標記技術(shù)為代表的分子育種技術(shù)已經(jīng)成為育種發(fā)展的重要方向。采用單基因防治病害存在較大的風險，容易引起單基因抗性喪失而造成較大的病害發(fā)生，而且不同的抗病基因之間還存在一定的協(xié)同作用，因此，聚合多個不同類型的抗病基因是解決目前水稻病害最切實有效的方法[6]。

分子標記輔助選擇（MAS，marker-assisted selection）是隨著現(xiàn)代分子生物學技術(shù)迅速發(fā)展而產(chǎn)生的新技術(shù)，其應用主要集中在基因聚合、基因滲入、根據(jù)育種計劃構(gòu)建基因系等方面[7]。利用MAS方法來囊括個體抗性遺傳組成，可以使不同來源的多種抗性基因聚合在1個栽培變種中。增加新的抗性基因來源對于提高水稻的抗病蟲能力及其持久性具有很大幫助[8]。因此，MAS是進行抗性基因聚合的最有效手段。近年來，育種學家利用MAS技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合的方法在聚合水稻抗性基因方面取得了較大的育種成效，培育出一批水稻新品系，其中一些品種（組合）已經(jīng)通過了審定；同時，在稻米品質(zhì)改良、高產(chǎn)利用等方面的研究也取得了一定進展[9]。

稻瘟病、白葉枯病和褐飛虱是影響水稻產(chǎn)量與質(zhì)量的主要病蟲害。目前，水稻抗病蟲性研究取得了巨大進展，已鑒定、定位和克隆了很多的抗病蟲基因，并在實踐中得到了廣泛應用。

1 水稻稻瘟病研究進展

1.1 稻瘟病概述

稻瘟病是世界水稻的主要病害，由真菌病原體（Magnaporthe oryzae） 引起。1919年在印度首次發(fā)現(xiàn)，當年造成水稻減產(chǎn)4%左右[10]。在隨后的稻瘟病發(fā)生過程中，僅僅在印度東部地區(qū)就造成水稻減產(chǎn)50%左右[4，11]。稻瘟病菌具有多樣性，在日本造成了水稻不同程度的減產(chǎn)（20%～100%）[12]。國外研究表明，全球每年由于稻瘟病造成的水稻減產(chǎn)量可以滿足6 000萬人口的糧食需求[13]，導致的直接經(jīng)濟損失高達50億美元[14]。

稻瘟病在水稻秧苗期至抽穗期均可發(fā)生。苗期或分蘗期發(fā)病嚴重時，可導致植株死亡；穗期發(fā)病會導致白穗或半飽和穗，產(chǎn)量大幅度降低，嚴重時可造成水稻絕收。稻瘟病病原菌的生理小種多樣，并且變異復雜。目前，對稻瘟病病原菌菌體的研究還停留在初步階段。病原菌在不同環(huán)境條件下具有變異性，應用單一的抗性水稻品種難以解決水稻持久抗稻瘟病的問題，很多抗性品種種植幾年后就喪失了抗性[15]，因此，培育具有持久抗性的水稻品種是育種家們主要的育種方向。實踐證明，培育具有持久抗性的水稻品種是防治稻瘟病最經(jīng)濟、有效的方法。所以，利用MAS技術(shù)將不同的抗性基因聚合，能夠在很大程度上提高品種抗性的持久度[16]。

1.2 水稻抗稻瘟病基因的定位與克隆

近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，分子定位成為鑒定水稻抗性基因最方便、直接的方法，且隨著水稻基因組測序的完成，越來越多的稻瘟病抗性基因被定位。1992年Mackill[17]首先發(fā)現(xiàn)并命名了2個抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-2（t），將其分別定位在第11號和第6號染色體；1994年Inukai等[18]得到了同樣結(jié)果。1999年Wang等[19]克隆了第1個稻瘟病抗性基因Pi-b，位于第2染色體長臂末端。截止到目前，已經(jīng)被鑒定和定位的抗稻瘟病基因達到了100個以上[20～96]（表1），且大部分抗稻瘟病基因分布在除第3號染色體外的其余11條染色體上，并在第6、11和12號染色體上有大的基因簇分布[97]（圖1），其中，約14%被定位于第6號染色體，約24%被定位于第11號染色體，約15%被定位于第12號染色體[98]。在定位的主效基因中，有26個基因 （Pi-a、Pi-b、Pi5、Pi-k、Pik-l、Pikh、Pik-m、Pik-p、Pi-sh、Pi-t、Pit-a、Pi-2、Pi-9、Pizt、Pigm、Pi-d2、Pi-d3、Pi-1、Pi-21、Pi-25、Pi-36、Pi-37、Pb-1、Pi50、Pi54和Pi54rh）已被成功克隆。

表1 已鑒定的抗水稻稻瘟病基因及其位點Table 1 Identified rice blast resistance genes and the loci

續(xù)表1

續(xù)表1

2 水稻白葉枯病研究進展

2.1 白葉枯病概述

水稻白葉枯病是由革蘭氏陰性菌黃單孢水稻變種（Xanthomonas oryzae pv.Oryzae Xoo） 引起的一種細菌性維管束病害，其通過葉尖和葉緣處的排水孔或傷口等進入葉片的被覆組織，隨后在其中積累并轉(zhuǎn)移至木質(zhì)部的導管中。該病可以在水稻的各個時期侵染，造成水稻不同程度的發(fā)病，在幼苗或分蘗期發(fā)病會造成水稻枯萎甚至死亡，一般水稻在分蘗后期發(fā)病嚴重，尤以抽穗期前后發(fā)病最快[99]。

白葉枯病首次在日本發(fā)現(xiàn)以來，在世界各地水稻種植區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，是僅次于稻瘟病的主要病害，嚴重影響水稻產(chǎn)量，發(fā)生嚴重時可造成水稻絕收[100]。在我國水稻種植區(qū)，白葉枯病主要影響長江流域及其以南的水稻產(chǎn)區(qū)，而對北方稻區(qū)影響較小。該病在潮濕和低洼地區(qū)較易發(fā)生，一般秈稻重于粳稻，雙季晚稻重于雙季早稻，單季中稻重于單季晚稻，粘稻重于糯稻[101]。

圖1 水稻抗稻瘟病基因在染色體上的分布Fig.1 Distribution of rice blast resistance genes on chromosomes

20世紀60年代末，國際水稻研究所利用當時流行的各種白葉枯病原菌系對廣泛收集的各國水稻品種進行鑒定，共鑒定出6個白葉枯病原菌生理小種和100多個抗源。這些抗源在雜交育種中廣泛使用，使得水稻抗病育種工作取得了突破性成就[102]。

多年研究表明，水稻白葉枯病是一種寄主性較強的病害。水稻對白葉枯病抗性遺傳所表現(xiàn)的寄主與病原菌之間的互作符合典型的基因?qū)虻年P(guān)系，也就是說，水稻白葉枯病菌的毒性是不同的，菌系在不同品種上致病力的差異表現(xiàn)為小種特異性的差異，品種攜有的主效抗病基因與所控制的病原菌系是相匹配的[100]。

20世紀90年代以前，我國植物病理學研究人員利用當?shù)氐蔫b別品種將本區(qū)域的Xoo分為不同的致病菌群，但由于這些研究采用的鑒別品種、接種方法和調(diào)查標準等各不相同，因此，彼此之間無法比較，難以全面了解全國水稻白葉枯菌系的分化。自60年代起，菲律賓國際水稻所和我國相繼對水稻白葉枯病的小種分化進行了研究[103]。根據(jù)水稻白葉枯病在水稻品種上特異性互作的標準不同，我國將水稻白葉枯病菌株劃分為7種致病型[104]（表2）。

表2 我國水稻白葉枯病菌的致病型Table 2 Pathogenic type of rice bacterial blight in China

2.2 水稻抗白葉枯病基因的鑒定、定位與克隆

多年以來，許多專家學者在白葉枯病基因的挖掘和鑒定等方面進行了大量研究，也取得了實質(zhì)性進展。日本是最早利用寄主抗性防治水稻白葉枯病的國家（從1923年開始進行抗病育種），同時也是最早鑒定出抗白葉枯病基因的國家。截至目前，有多個抗白葉枯病基因已被鑒定和定位，國內(nèi)外科研人員已鑒定了41個抗水稻白葉枯病基因[105～147]（表3）。其中，29個基因為顯性基因，其他基因均為隱形基因，分別位于除第9和第10號染色體外的其他10條染色體上[148]（圖 2），有 8 個基因 （Xa1、Xa3/Xa26、Xa5、Xa10、Xa13、Xa21、Xa23和Xa27） 已被克隆 （表4）。

表3 已鑒定的水稻抗白葉枯基因及其位點Table 3 Identified rice bacterial blight resistance genes and the loci

3 水稻褐飛虱研究進展

3.1 褐飛虱概述

褐飛虱（Nilaparvata lugens St?l）屬遷飛型水稻害蟲，其生命周期分為卵、若蟲和成蟲3個階段。卵主要產(chǎn)在稻株下部葉鞘內(nèi)，在老的稻株上產(chǎn)在葉片中脈兩側(cè)組織內(nèi)。若蟲分5齡，體長卵圓形，其中，初齡若蟲體長約1 mm，5齡若蟲體長約3 mm[149]。成蟲的翅型有短翅型和長翅型2種，其中，短翅型褐飛虱屬定居型，繁殖能力強，發(fā)育進度快；長翅型屬遷飛類型，在羽化后不久就具飛翔能力，長翅型群體在一定條件下能隨氣流上升并借助風力做遠距離遷徙。因此，褐飛虱種群分布很廣，區(qū)域包括東亞、東南亞、南亞次大陸、澳大利亞北部及南太平洋群島[150]。長、短翅型的分化受基因控制，但環(huán)境因子如光照、溫度、濕度、稻株營養(yǎng)、稻株生育期和蟲口密度等均能影響翅型的分化[151]。即使在相同的遺傳基礎條件下，褐飛虱的翅型仍可因外界條件的不同而發(fā)生變化，即：在不同的環(huán)境條件下，基因在表達方面存在著很大差異，翅型分化是由1個受多種因子影響的調(diào)控體系決定，且調(diào)控作用與性別有關(guān)[152]。

圖2 水稻抗白葉枯病基因在染色體上的分布Fig.2 Distribution of rice bacterial blight resistance genes on chromosomes

表4 已克隆的水稻抗白葉枯病基因及其功能與表達Table 4 Cloned rice bacterial blight resistance genes and the function and expression

在種植水稻的亞洲國家，褐飛虱是破壞性很強的害蟲之一。褐飛虱直接吸食植物的液汁，嚴重時會導致“葉蟬燒”，造成植物整體變色和脫水，甚至死亡[153]。褐飛虱不僅直接取食造成水稻減產(chǎn)，而且還是壯矮縮病和曲矮縮病病毒的攜帶者，因此，對水稻的為害更加嚴重[154，155]。20世紀60年代之后，隨著耕作技術(shù)的改變以及高產(chǎn)雜交水稻品種的大面積推廣應用，褐飛虱由原本僅在中國南方稻區(qū)偶有發(fā)生逐漸向北擴展并頻繁為害，且為害程度呈逐漸加重趨勢，每年受褐飛虱為害的水稻種植面積高達400萬hm2以上[156]。僅2005年和2008年，褐飛虱直接為害造成的我國稻谷損失量就高達27億kg；同期在越南，褐飛虱傳播的草狀叢矮縮病和齒葉矮縮病間接造成稻谷損失 0.4億 kg[157]。

在過去的50 a，提高宿主抗性一直被認為是一種減少因褐飛虱而造成產(chǎn)量損失的有效方法，國際水稻研究所和其他國家的很多研究者已經(jīng)把水稻抗褐飛虱研究作為1個主要的研究方向[158]。早在20世紀70年代，國際水稻研究所已經(jīng)開始選育抗褐飛虱的水稻品種[159]。

20世紀70～80年代，由于褐飛虱在亞洲暴發(fā)，使得培育水稻抗褐飛虱品種的研究達到了頂峰階段；期間，國際水稻研究所育成了一系列含有單個抗褐飛虱主效基因的抗蟲品種，并有效地抑制了褐飛虱的為害。到了20世紀90年代，水稻抗褐飛虱的研究和育種工作逐漸減少[160]。然而，從20世紀90年代中期開始，科技工作者在水稻遺傳和分子方面的持續(xù)研究使得大量的水稻抗褐飛虱基因和數(shù)量性狀位點（QTL）被發(fā)掘，加上近幾年褐飛虱在亞洲為害加重，水稻抗褐飛虱的研究又一次成為了熱點，研究人員希望通過遺傳和分子方面的信息育成新的并具有持久抗性的水稻新品種[161]。在亞洲已經(jīng)育成了很多具有抗性的品種并進行了推廣，但是，隨著時間的推移，一些含有抗性基因的品種抗蟲性會發(fā)生退化，從而產(chǎn)生適應該類抗性基因的褐飛虱生物型，最終將會導致當?shù)睾诛w虱種群再次發(fā)生暴發(fā)增長。因此，如何提高水稻抗蟲的持久性，逐漸成為了科技工作者主要的研究方向。實踐證明，培育多基因聚合的抗褐飛虱品種能夠顯著增強水稻的廣譜抗性，且能夠增加水稻抗蟲的持久性。

3.2 水稻褐飛虱的生物型

生物型指同種害蟲的不同群體生活在特定的寄主上表現(xiàn)出不同的生存和發(fā)育能力或?qū)闹魅∈澈彤a(chǎn)卵有不同的嗜好性，曾被許多研究者用來表述致害性不同的類型。目前，已命名了20多種褐飛虱小種。一般將其劃分為4種生物型：生物型I、生物型II、生物型III和生物型IV。其中，生物型I和生物型II主要分布于東亞和東南亞稻作區(qū)，是最常見的褐飛虱生物型；生物型III是國際水稻研究所產(chǎn)生的實驗種群；生物型IV被認為是致害性最強的種群，分布于南亞次大陸[162]。這4種生物型是學者們研究的重點。其他命名的生物型還有李氏禾生物型[163]、澳大利亞型、Mindanao型、Parwanipur型和“九龍江型”等[164]。研究表明，中國各稻區(qū)的褐飛虱種群是以生物型II為主的混合群體，在田間自然種群中生物型II占60.1%、生物型I占12.9%[165]。褐飛虱生物型的多樣性及其變異機制的復雜性，使得褐飛虱抗性育種工作難度加大。因此，亟須對褐飛虱生物型進行更加深入的研究[166]。

3.3 水稻抗褐飛虱基因的鑒定與克隆

自20世紀70年代起，各國相繼展開了水稻褐飛虱抗性基因的發(fā)掘工作，第1個抗褐飛虱位點于1970年被鑒定。在最近幾年抗褐飛虱基因逐漸被發(fā)掘出來，目前國內(nèi)外文獻記載已鑒定的抗褐飛虱主效基因共35個[167～201]（表5），其中29個基因被定位于水稻7條染色體的不同區(qū)域，且主要位于第4號和第12號染色體[202]（圖3），均占總數(shù)的33.3%。

近年來，國內(nèi)外研究人員在水稻抗褐飛虱基因的克隆研究方面取得長足進展[203]。目前，已經(jīng)被克隆的褐飛虱抗性基因有位于水稻第3號染色體長臂端的Bph14，位于水稻第4號染色上著絲粒附近的Bph3，位于第12號染色體長臂端的Bph18和Bph26以及位于第6號染色體上的Bphi008a和Bph29。其中，Du等[186]運用圖位克隆法從藥用野生稻滲入系B5中成功克隆了Bph14，該基因編碼包含1個螺旋卷曲-核苷酸結(jié)合-富含亮氨酸重復（CC-NB-LRR） 的基序蛋白，主要在維管組織的薄壁細胞中組成型表達，攜帶該基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株在受到褐飛虱的取食后植株韌皮部細胞胼胝質(zhì)沉積以及產(chǎn)生胰蛋白酶抑制劑抑制了褐飛虱的取食而使植株產(chǎn)生抗性。Liu等[171]利用水稻品種Rathu Heenati（RH） 將Bph3定位在第4號染色體短臂端并克隆，發(fā)現(xiàn)Bph3是由3個編碼凝集素類受體蛋白激酶（OsLecRK1-OsLecRK3） 的基因組成的基因簇，編碼的凝集素類受體蛋白激酶是介導水稻具有廣譜持久抗蟲效果的主要原因。Jena等[204]利用圖位克隆技術(shù)成功克隆了位于第12號染色體長臂端的Bph18，該基因編碼1個螺旋卷曲-核苷酸結(jié)合位點（CC-NBS） 蛋白，其富亮氨酸重復結(jié)構(gòu)域（LRR） 缺失。Tamura等[197]成功克隆了位于第12號染色體上的基因Bph26，其編碼1個R（CC-NB-LRR） 蛋白，該基因能夠抑制褐飛虱在水稻韌皮部篩管部位取食。Hu等[201]利用抑制差減雜交方法得到1個受褐飛虱取食誘導的單拷貝基因Bphi008a，其表達亦可以被機械傷害以及外源乙烯利所誘導，該基因是1個乙烯信號途徑下游的效應基因，在植物體內(nèi)被磷酸化后通過與OsbZIP60以及SDRP互作組成1個轉(zhuǎn)錄復合體來調(diào)控一系列OsMAPKS的表達，并最終提高水稻對褐飛虱的抗性。Wang等[200]將Bph29克隆，該基因被定位在第6號染色體短臂上24 kb的區(qū)域，Bph29編碼的蛋白包含1個高度保守的B3DNA結(jié)合域，Bph29在維管束組織中表達，可抑制褐飛虱取食。以上基因的成功克隆使它們介導的抗性機理得以闡明，為抗性育種工作奠定了重要基礎。但是，水稻對褐飛虱的抗性機制復雜。因此，只有對抗性基因進行更進一步的研究，才能對其抗性機制有更深入的認識。

表5 已鑒定的水稻抗褐飛虱基因及其位點Table 5 Identified rice brown planthopper resistance gene and the loci

圖3 水稻抗褐飛虱基因在第4號和第12號染色體上的分布Fig.3 Distribution of rice brown planthopper resistance genes on chromosome 4 and 12

通過分析已克隆的基因，CC-NB-LRR結(jié)構(gòu)域?qū)儆赗蛋白。R蛋白由R基因編碼而來，根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的不同，研究人員將其分成5類[205]。其中，NB-LRR結(jié)構(gòu)域是R蛋白中最多的一類；CC-NB-LRR結(jié)構(gòu)域是其中的一種；B3結(jié)構(gòu)域是在高等植物中廣泛存在的一種結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能編碼110個氨基酸組成的蛋白，是一種能與DNA接合的高度保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在植物的逆境脅迫相應和生長發(fā)育過程中起著極其重要的作用[206]，該結(jié)構(gòu)域是R蛋白中新發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)構(gòu)域，對植物抗病蟲的研究有著十分重要的意義。

4 水稻抗病蟲基因聚合研究的應用

當前，許多的抗病蟲基因已經(jīng)被定位，而且也有一部分被廣泛利用，抗病蟲的水稻品種培育也取得了一定的進展。但是，目前培育的品種大多為單基因抗性品種，專一性較強，而專一性品種難以滿足生產(chǎn)上對病蟲害的抗性需要[207]。為了防范單基因抗病蟲害品種大面積種植后出現(xiàn)抗性喪失的問題，有必要進一步拓寬抗病蟲基因的材料來源，克隆出抗性譜不同的抗病蟲基因[208]，并明確這些基因在不同秈、粳稻品種遺傳背景下的抗病蟲效應。按照設計育種的原理與要求，通過MAS進行基因聚合，不同抗病蟲基因間相互組合與作用將會為新育成的水稻品種提供更加穩(wěn)定和持久的抗性[203]。

育種家利用MAS技術(shù)在聚合水稻抗性基因方面取得了較大的育種成效，選育出一批水稻新品系，其中一些品種（組合）已通過審定；而且，在稻米品質(zhì)改良、高產(chǎn)的利用等方面也取得了一定的研究進展[9]。

Liu等[209]利用MAS技術(shù)將2個抗褐飛虱基因Bph3和Bph27（t）導入到易感品種Ningjing3中，得到的聚合系在很大程度上提高了對褐飛虱的抗性，避免了由于褐飛虱影響而造成的產(chǎn)量損失；李進波等[210]利用MAS技術(shù)，結(jié)合雜交和回交手段，將抗褐飛虱基因Bph14與Bph15進行聚合，獲得了抗褐飛虱的雙基因聚合株系；李進波等[211]以GD-7為稻瘟病抗性基因供體、揚稻6號為受體，通過回交轉(zhuǎn)育結(jié)合MAS，選育出10個雙基因（Pi1和Pi2）純合且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的水稻新品系，并在湖北省水稻品種區(qū)域試驗的稻瘟病抗性鑒定點恩施和宜昌分別進行了稻瘟病抗性田間鑒定，結(jié)果顯示，這些品系的抗性綜合指數(shù)在0.8～2.0，抗級為1級，稻瘟病抗性與較易感病的受體親本相比顯著提高；Hu等[212]利用MAS技術(shù)也將水稻抗褐飛虱基因Bph14和Bph15同時聚合到汕優(yōu)63的親本珍汕97B和明恢63中，以此來增強汕優(yōu)63對褐飛虱的抗性；Hu等[213]利用MAS技術(shù)將3個抗褐飛虱基因Bph14、Bph15和Bph18聚合到易感品種9311中，結(jié)果顯示，幾個基因聚合后對褐飛虱的抗性有累加效應（Bph14/Bph15/Bph18≥Bph14/Bph15＞Bph15/Bph18≥Bph15＞Bph14/Bph18≥Bph14≥Bph18＞無），對比后發(fā)現(xiàn)聚合了3個基因的水稻對褐飛虱具有更強的抵抗力且稻谷產(chǎn)量也得到了提高；Xiao等[214]為了改良恢復系華占的抗病能力，將抗白葉枯病基因Xa23以及抗褐飛虱基因Bph14和Bph15通過分子標記輔助回交策略導入到恢復系中，提高了恢復系的抗性，且改良后水稻產(chǎn)量也有一定的增加；劉開雨等[215]通過利用MAS技術(shù)，并結(jié)合回交以及抗蟲鑒定的方法，將抗褐飛虱的基因Bph3和Bph24（t）分別導入主栽雜交水稻恢復系中，通過表型鑒定最終獲得抗性最強的聚合系，表明通過對抗性基因的聚合能夠增加品種對褐飛虱的抗性；Usatov等[216]利用MAS技術(shù)成功地將3個抗稻瘟病基因Pi1、Pi2和Pi33聚合到俄羅斯的水稻品種中，提高了俄羅斯水稻品種的持久抗性；樓鈺等[217]結(jié)合分子標記輔助輪回選擇和田間鑒定的方法，將抗稻瘟病基因Pi-GD-1（t）和Pi-GD-2（t）、抗白葉枯病基因Xa23和抗褐飛虱基因Bph18（t）導入3個中秈恢復系，獲得了8個兼抗稻瘟病和褐飛虱的聚合系，這些聚合系及其與不育系五豐A的測交種對稻瘟病和褐飛虱的抗性水平接近或略低于稻瘟病抗性親本和褐飛虱抗性親本。部分改良恢復系及其測交種對白葉枯病表現(xiàn)為抗病或中抗，改良恢復系及其測交種在正常條件下農(nóng)藝性狀與原始恢復系及其測交種相仿或更優(yōu)，具有生產(chǎn)應用價值；鄒聲浩[218]利用MAS技術(shù)將抗稻瘟病基因Pi9和Pid2以及抗褐飛虱基因Bph14和Bph15導入兩系不育系03S中，選育出與03S表現(xiàn)型相似且抗性良好的單株，改良了兩系雜交稻不育系的抗性。張曉[219]將具有抗褐飛虱雙基因Bph14和Bph15以及抗螟蟲基因Cry1Ab/Ac的中秈品系07WH3009作為供體親本，以優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、株型好、配合力強等農(nóng)藝性狀優(yōu)良的華1176、華261、華恢910和華恢729作為受體親本，選育出1批含有抗褐飛虱雙基因、單基因的中間材料；胡巍等[220]利用MAS和連續(xù)回交的方法，將來源于栽培稻的抗褐飛虱基因Bph3、來源于野生稻的抗褐飛虱基因Bph14和Bph15分別轉(zhuǎn)入到華南高產(chǎn)水稻品種桂農(nóng)占中，褐飛虱抗性評價結(jié)果表明，在含單個抗性基因的株系中，含抗性基因Bph3的株系抗性水平最高，含抗性基因Bph14的株系抗性水平最低，而含Bph14和Bph15雙基因株系的抗性水平高于含單個基因株系的抗性水平；王金明等[221]利用水稻抗稻瘟病基因Pi40和Pib的特異PCR標記，對含有Pi40和Pib水稻品系復合雜交F2的50個植株進行檢測，從中選擇到Pi40和Pib的雙基因聚合抗病植株28個；Hasan等[222]將3個抗稻瘟病基因Pi-7（t）、Pi-d1（t）和Pir2-3（t）以及 1個抗稻瘟病數(shù)量性狀位點（QTL）qLN2成功導入到馬來西亞的優(yōu)良品種MR263中，增強了MR263對稻瘟病的抗性；杜太宗等[223]通過MAS技術(shù)將稻瘟病抗性基因Pi1和Pi9聚合到金23B中并進行田間自然誘發(fā)鑒定，成功發(fā)現(xiàn)對葉瘟和穗頸瘟抗性提高的聚合材料；Ji等[224]將3個抗稻瘟病基因（Pi1、Pi2、Pita）、2個抗白葉枯病基因（Xa23、Xa5） 和1個抗褐飛虱基因（Bph3） 聚合到同一品種中，得到1份同時含有3種抗性基因的新品系，隨后進行了2 a的種植試驗，結(jié)果證明聚合了3種抗性基因的新品系對3種病蟲害的抗性明顯增強；Hu等[225]利用分子標記輔助回交選擇方法將3個抗褐飛虱基因聚合到華南的秈稻品種Hemeizhan（HMZ）中，得到的品系表現(xiàn)出了很強的抗性，同時發(fā)現(xiàn)，聚合的基因個數(shù)與抗性水平呈正相關(guān)（Bph3＋Bph14＋Bph15≥Bph3＋Bph15≥Bph3＋Bph14≥Bph14＋Bph15≥Bph3≥Bph15≥Bph14＞無），選育出的水稻抗褐飛虱新品系對于提高其他栽培品種的抗性是良好的中間材料。

以上研究表明，水稻中抗病蟲基因的多樣化是應對生物型或小種變異的重要措施，是增強水稻品種廣譜和持久抗性的重要基礎。

5 問題與展望

隨著分子生物學新成果和新技術(shù)的不斷出現(xiàn)，以及基因組學和生物信息學等學科的深入研究，MAS技術(shù)漸漸成為了目前育種工作的有利手段。目前，我國在水稻抗病蟲研究上基礎研究較多，具體的品種選育研究較少[226]，雖然在水稻抗病蟲基因的鑒定、分子作圖和利用、生物型變異以及培育抗病蟲品種等方面已取得了很大進展，但是也出現(xiàn)了很多問題：（1）MAS并不像當初設想的那么廣泛，基因的發(fā)掘數(shù)量不夠大，遺傳信息聯(lián)系不夠緊密，容易受到遺傳背景的影響，而且，有一些基因的定位不夠精確，單一的抗病蟲品種壽命短，易誘發(fā)形成新的小種或生物型，使品種的抗性喪失；（2）基因克隆的進度緩慢，難以滿足育種者對基因的需求。因此，在水稻抗病蟲育種上應不斷挖掘抗譜廣、抗性強的基因。加之現(xiàn)有的抗性基因的分子標記在一些育種群體沒有多態(tài)性，所以，應該加強水稻抗性基因緊密連鎖標記的開發(fā)，使育種家對分離群體的選擇更加準確，提高育種效率[227]。

另外，在抗病蟲育種方面，經(jīng)過多年的驗證，由單基因控制的水稻品種易受小種或生物型的變化而失去作用。一般認為，微效多基因的利用有助于保持水稻對病蟲害的持久抗性，但這方面的研究還相對較少，研究基礎比較薄弱[228]。

因此，需要持續(xù)、深入、系統(tǒng)地了解水稻生長發(fā)育的分子機制，完善現(xiàn)有分子育種相關(guān)的種質(zhì)資源信息系統(tǒng)，結(jié)合分子標記輔助選育與水稻分子設計，培育具有廣譜和持久抗性的水稻新品種，進而減輕抗性品種對病蟲害的選擇壓力。同時，增加品種的廣譜和持久抗性也是目前水稻抗病蟲分子育種發(fā)展的主要方向。